Aspergillus niger ATCC1015胞外糖苷水解酶的动态酶谱及特定酶功能分析

摘要

木质纤维素是自然界中含量最丰富的清洁可再生的资源，其主要成分包括纤维素、半纤维素、果胶和木质素。经过多年的研究，生物质产品的化学转化和酶转化过程都非常低效，且费用较高，而转化效率低的部分原因在于人们对生物质本身的结构缺少深入的认识，而植物细胞壁分子结构复杂且成分多样，构成了生物质抗降解屏障。多数纤维素的降解是由微生物来完成的，其中丝状真菌能够分泌大量的木质纤维素酶，我们的研究表明，来自于聚糖降解产生的纤维寡糖及其衍生物是木质纤维素酶类的真正诱导物。然而，人们对微生物是如何精细表达胞外糖苷水解酶的仍然还不清晰，仍是研究的重点。本研究以丝状真菌A.nigerATCC1015为研究对象，利用实验室建立的动态酶谱技术以及液相色谱-质谱联用技术对其展开了相关研究，以探究糖苷水解酶和诱导物之间的关系，并对部分混杂性的酶进行异源表达和功能研究取得了如下实验结果:
　　1、A.nigerATCC1015感知环境中碳源种类精细调节糖苷水解酶的表达
　　研究发现，A.nigerATCC1015对碳源种类和碳源浓度具有不同的响应。A.nigerATCC1015胞外糖苷水解酶的表达具有一定的时序性，木聚糖酶在48h分泌、内切纤维素酶在72h分泌，而β-葡萄糖苷酶则在96h以后分泌。糖苷水解酶的表达规律与底物种类具有相关性，无论在摇瓶培养或者发酵罐培养条件下，甘油、葡萄糖和纤维二糖不能高效诱导表达A.niger的多种糖苷水解酶，而木糖、木聚糖、CMC和微晶纤维素PH105都能诱导表达Xyn2（即XynB）和Egl5(即EglA)。而且木糖和纤维二糖的混合糖能够高效诱导表达Xyn1和XynB两种木聚糖酶、Egl1、Egl3和EglA三种内切纤维素酶。随着诱导性碳源木糖、木聚糖、CMC和微晶纤维素PH105浓度的增加，半纤维素酶中Xyn1和XynB的表达量增加，酶活上升;同时，纤维素酶Egl5表达也增加，酶活随之升高，出现的时间有所提前。但是当培养基中可溶性的还原糖积累到一定程度之后，则对这些糖苷水解酶的表达具有一定的阻遏作用，表现为出现的时间延迟，如低浓度木糖一般48h之内表达木聚糖酶，木糖浓度为2％时延迟到72h，继续增加至3％时，进一步延迟至96h。在以聚糖为碳源时，A.nigerATCC1015感知环境中存在的微量的可溶性的寡糖成分能够诱导表达部分酶类，产生的微量的糖苷水解酶则可降解环境中的聚糖成分产生多种聚合度不一的可溶性的纤维寡糖或者木寡糖在环境中积累，进一步诱导其它糖苷水解酶的表达，所以我们认为是来自于高聚物降解产生的纤维寡糖或者其衍生物是真菌糖苷水解酶的真正的诱导物。
　　2、利用LC/MS技术系统分析A.nigerATCC1015不同诱导条件下胞外木质纤维素降解酶类
　　利用液相色谱-质谱联用技术，更快速全面地对胞外糖苷水解酶的种类进行系统分析。通过对比四种高效诱导性碳源条件下胞外蛋白质组中糖苷水解酶种类的对比发现，秸秆粉和麸皮的混合物诱导的糖苷水解酶的蛋白含量远远高于木糖、木聚糖、木糖+纤维二糖条件下的胞外蛋白，而且大量表达其它碳源不能诱导表达的复杂多样的果胶酶类。四种情况下的半纤维素酶都比较丰富，而且木糖、木聚糖和木糖+纤维二糖培养条件下主要表达半纤维素降解酶，可知A.niger是半纤维素酶高表达菌株。通过对比动态酶谱结果，四种碳源条件下均检测到EglA、Bgl、XynA、XynB和XynD，结果一致。木聚糖酶的动态酶谱结果与质谱结果一致，一共三种木聚糖酶，Xyn2即XynB一直持续高效表达，Xyn1即XynA以及含量较少的XynD均检测到，所以可知LC-MS的分辨率较高。数据结果也侧面证明了复杂底物能够高效诱导多种糖苷水解酶的表达。除此之外，四种碳源条件下都检测到高含量的淀粉酶蛋白，也说明了Aniger是淀粉酶高产菌株。
　　3、重要的糖苷水解酶的异源表达和功能分析
　　通过动态酶谱技术和LC-MS技术发现在相同碳源诱导条件下，A.niger胞外表达多种同工酶，其中EglA和XynB在大部分碳源上优先表达且持续高效表达，为了探究真菌分泌多种同工酶的原因以及EglA和XynB的作用，本实验想通过将这些酶异源表达得到纯酶之后对酶进行功能研究。本实验成功表达得到GH11的内切葡聚糖酶XynB(EC3.2.1.8)。A.nigerATCC1015的Xyn1经鉴定是属于GH10的XynA，Xyn2和XynB是同源蛋白，在多种条件下持续高效表达，在XynB的作用下木聚糖水解产生多种低聚木寡糖，而且XynB能够水解无定型纤维素，产生单糖、二糖和三糖，为其他糖苷水解酶的表达提供多种寡糖诱导物。另一种成功表达的酶是在大部分条件下优先表达且具有木葡聚糖酶活的GH12的内切纤维素酶EglA(EC3.2.1.4)。EglA能够水解RAC产生二糖、三糖和四糖，CMC在EglA的作用下产生一系列的纤维寡糖。我们推测真菌优先表达XynB或者EglA的原因在于，首先二者的分子量小，合成耗能少。另外，二者底物专一性不高，降解多糖底物产生的多种可溶性的寡糖作为诱导物进一步诱导其它多种糖苷水解酶的表达。动态酶谱