Aspergillus niger An--76对不同碳源的精细响应及其胞外糖苷水解酶的表达分泌

摘要

木质纤维素是植物细胞壁的主要成分，是重要的可再生资源，主要包含纤维素，半纤维素及木质素等成分。利用木质纤维素生产生物能源以及生物化工产品对降低化石能源依赖度，解决温室气体排放等环境问题具有重要意义。在生物进化过程中，植物细胞壁的多种成分形成了复杂的结构，植物利用这种结构抵御微生物等对植物细胞壁结构多糖的侵害。这些化合物及其形成的超分子结构被统称为“生物质抗降解屏障”。另一方面，作为生物圈中生物质的主要分解者，微生物在碳循环过程中起着重要的作用，尤其是丝状真菌等木质纤维素降解微生物。在长期的进化过程中，这些微生物形成了合成并分泌具有不同底物特异性的复杂糖苷水解酶系的能力。然而，至今为止，有关木质纤维素降解过程中底物与酶分子之间的相互作用关系，反映天然状态下底物超分子结构信息的诱导物以及微生物胞外酶系的精细表达调控过程等问题仍然未能得到阐明，仍然不能回答纤维素的降解需要多种同工酶、完全降解木质纤维素需要的酶的种类以及如何进行酶系重构才能达到木质纤维素酶解效率的最大值等问题。因此，建立适当的研究方法分析糖苷水解酶系的精细表达分泌将有助于木质纤维素多糖水解酶系重构及提高酶解效率等方面的研究。基于以上研究背景，本文开展了一系列相关研究，并取得了以下成果: 1.基于Native-PAGE建立了反映胞外酶系动态变化的酶谱技术 在Nativce-PAGE技术的基础之上，建立了可用于分析功能蛋白质组的动态酶谱方法。动态酶谱方法不仅可以对微生物木质纤维素多糖降解酶系进行传统的酶活测定与酶的种类进行分析，还可以具体到对单一特定的酶组分进行功能分析，同时能够准确定量分析不同酶组分对总酶活的贡献，并且系统地分析每一酶组分随时间的动态变化过程。相对于单纯的蛋白质组学而言，该项技术更具有针对性，因此也更易找到限制木质纤维素多糖水解酶系降解效率的主要影响因素。 2.木质纤维素降解过程中释放的寡糖诱导了A.niger An-76胞外不同糖苷水解酶的特异性表达 利用动态酶谱技术，对A.niger An-76在含有不同碳源的发酵过程中合成的糖苷水解酶系进行了系统的分析。研究发现，聚糖水解产物的种类和浓度可以有效地调控A.niger An-76的胞外糖苷水解酶分泌。实验发现，内切纤维素酶同工酶的分泌普遍晚于木聚糖酶同工酶大约24h。这些糖苷水解酶同工酶的诱导过程具有很大的差异，高浓度的木糖能够阻遏部分内切木聚糖酶的表达(例如Xyn1/XynA)并同时能够触发低水平的内切纤维素酶的表达(Egl3/EglA)。有些内切纤维素酶和木聚糖酶的同工酶能够被混合多糖水解产物诱导(如Xyn1/XynA和Egl1)，而其他一些同工酶却能够被特定的多糖水解产物的变化所影响(如Xyn2，Xyn3/XynB, Egl2和Egl4)。 3.A.niger An-76内切纤维素酶系的碳源诱导及优化 研究发现，通过改变底物组成可有效提高A.niger An-76胞外内切纤维素酶的生产效率。CMC和木聚糖的混合碳源可以高效诱导内切纤维素酶的表达。使用玉米秸秆粉，小麦麸皮和汽爆秸秆做为廉价碳源的替代研究发现，在发酵过程中添加少量的天然半纤维素浸出物可有效提高内切纤维素酶诱导表达与分泌的效率。同时，如以木质纤维素浸出液和气爆秸秆为碳源时，通过降低固体碳源的粒度以及补加少量CMC等，其纤维素酶的生产成本和效率将优于单纯以CMC和木聚糖为碳源组合的培养。 4.A.niger An-76表达调控关键糖苷水解酶组分的功能分析 双向电泳的实验结果证明A.niger An-76胞外糖苷水解酶的表达调控及蛋白质的分泌明显受到碳源种类的影响。通过动态酶谱以及虚拟酶切技术，对Egl3/EglA，Xyn1/XynA和Xyn3/XynB这3个酶组分进行了鉴定分析。其中Egl3/EglA是一种内切纤维素酶(EC3.2.1.4)，在发酵过程中该酶的存在可降解结构多糖并产生一系列寡糖，这些寡糖能够起到糖苷水解酶诱导物的作用。Xyn1/XynA是一种内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)，通过发酵实验发现Xyn1/XynA组分具有与T.reesei中的木聚糖酶相似的灵活调控机制，对底物浓度较为敏感。通过2步分离纯化，获得了电泳纯的Xyn1/XynA组分，为下一步的深入研究打下了基础。Xyn3/XynB是另一种内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)。另外，通过双向电泳和质谱技术，鉴定出与A.niger CBS513.88的Bgl1(An18g03570)同源的β-葡萄糖苷酶。 5.对A.niger An-76相关基因转录调控元件进行了系统的生物学分析 对已经测序的A.niger模式菌株A.niger CBS513.88中的部分糖苷水解酶基因的启动子进行了转录调控元件的统计分析。这些转录调控元件主要包括XlnR，AceⅡ，CCAAT结合复合体，AceⅠ以及CreA。为了提高分析的准确性，将分析序列区域扩大到ORFs上游2000bp。分析发现，同工酶编码基因的启动子具有特异性的转录调控元件种类与分布。这种特异和个性化的转录调控元件分布为酶系的精细表达调控提供了转录水平上的物质基础。 今后糖苷水解酶酶系重构改造的研究中，应重点研究真核生物所特有的多调控因子协同机制和不同酶组分的高效诱导方式;针对不同底物结构和成分的具体特性，改造或者重构基因的表达调控区，通过更加特异有效的酶系改造形成并建立新的酶系合成标准，最大程度地模仿自然状态下生物质降解过程，从而有效提高生物质的转化效率。

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章 绪论

1．1 木质纤维素及其超分子结构

1．1．1 植物细胞壁的解剖结构

1．1．2 木质纤维素的主要成分及其结构

1．1．3 纤维索的合成及相关酶系

1．1．4 非纤维素多糖的合成及相关酶系

1．1．5 木质素的结构及特征

1．1．6 木质纤维素结构对生物质转化效率的影响

1．2 微生物降解木质纤维素的糖苷水解酶系统

1．2．1 降解木质纤维素的主要微生物类群

1．2．2 糖苷水解酶的分类

1．2．3 典型糖苷水解酶系统及其特征

1．2．4 典型丝状真菌的糖苷水解酶系统及其机制

1．2．5 木质纤维素多糖水解酶对生物质转化效率的影响

1．3 丝状真菌糖苷水解酶的碳源响应及调控

1．3．1 丝状真菌糖苷水解酶系的主要诱导物

1．3．2 诱导物的跨膜转运及信号传递

1．3．3 糖苷水解酶基因的转录调控因子

1．3．4 糖苷水解酶基因启动子和信号肽改造的相关研究

1．3．5 糖苷水解酶系统的重构改造

1．3．6 糖苷水解酶表达调控的系统学分析

1．4 木质纤维素降解转化研究的技术方法

1．4．1 木质纤维素结构分析技术

1．4．2 组学技术的应用

1．4．3 数据图像定量处理技术

1．5 立题依据

第2章 糖苷水解酶动态酶谱方法的建立

2．1 材料与方法

2．2 结果与分析

2．2．1 胞外糖苷水解酶系的活性检测

2．2．2 定量分析胞外糖苷水解酶的动态变化

2．3 讨论

第3章 发酵过程中糖苷水解酶与碳源的动态响应关系

3．1 材料与方法

3．2 结果与分析

3．2．1 发酵过程中糖苷水解酶的酶谱重现性与稳定性

3．2．2 碳源种类对胞外蛋白酶谱的影响

3．2．3 木糖、纤维二糖及纤维糊精做为碳源时对木聚糖酶表达的影响

3．2．4 木糖、纤维二糖及纤维糊精作为碳源时对内切纤维素酶表达的影响

3．2．5 不同碳源发酵时胞外β-葡萄糖苷酶的动态变化

3．3 讨论

第4章 碳源对内切纤维素酶的影响及产酶优化

4．1 材料与方法

4．2 结果与分析

4．2．1 单糖作为单一碳源时对内切纤维素酵系表达的影响

4．2．2 聚糖作为单一碳源时对内切纤维素酶系表达的影响

4．2．3 混合糖为碳源对内切纤维素酶系表达的影响

4．2．4 天然木质纤维素为碳源时对内切纤维素酶系表达的影响

4．2．5 秸秆麸皮为碳源的固体发酵对内切纤维素酶合成的影响

4．2．6 不同碳源及发酵方式对内切纤维素酶系产酶效率的分析

4．3 讨论

第5章 重要胞外糖苷水解酶的表达纯化及功能分析

5．1 材料与方法

5．2 结果与分析

5．2．1 动态酶谱-质谱法鉴定胞外糖苷水解酶

5．2．2 Xyn1／XynA的分离纯化及其功能分析

5．2．3 Egl3／EglA在胞外内切纤维素酶系中的作用及功能分析

5．2．4 碳源差异对胞外蛋白质组的影响及部分蛋白质的质谱鉴定

5．3 讨论

第6章 糖苷水解酶表达的系统生物学分析与预测

6．1 材料与方法

6．2 结果与分析

6．2．1 胞外木质纤维素降解酶组分的时序性表达分析

6．2．2 转录调控因子结合位点对糖苷水解酶基因表达顺序的影响

6．2．3 TFBS与信号分子调控部分糖苷水解酶表达的模拟分析

6．3 讨论

全文总结与展望

附录一 糖苷水解酶表达调控方程推导

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢