沙门氏菌FliT-FliD蛋白复合物及大肠杆菌O157:H7 Z0021蛋白结构与功能研究

摘要

鞭毛位于细菌的表面，是细菌主要的运动器官。自然界中，通过鞭毛的推动作用细菌能逃离不利的环境，到达营养更丰富、更利于其生存的环境中。有些肠道致病菌在鞭毛的推动作用下，能很快的吸附到上皮细胞表面，进入血液，使宿主致病。因此，越来越多的新型抗菌药物都选择鞭毛的合成途径作为靶点。
　　细菌鞭毛的合成是一个自组装的过程。它是由一系列的蛋白组成的一个大的蛋白质复合体。与鞭毛合成相关基因的转录翻译都有着严格的调控。按照基因的转录顺序，鞭毛基因被分为三类:第一级、第二级以及第三级鞭毛基因。flhDC操纵子处于整个鞭毛基因转录翻译的最上游，首先被翻译出来。此操纵子翻译出来的FlhD和FlhC两个蛋白能组装成异源蛋白六聚体FlhD4C2。FlhD4C2复合物是一种转录调控因子，能促进第二级鞭毛基因的转录。二级鞭毛基因主要表达基体、钩形鞘蛋白及鞭毛特异性转录因子δ28。三级鞭毛基因主要负责鞭毛蛋白、一些调控蛋白及一些未知功能蛋白的表达。
　　鞭毛蛋白的表达和组装过程受不同层次上很多因子的调控。鞭毛基因的调控涉及到DNA水平、mRNA水平及蛋白水平，FlhD4C2复合体是鞭毛合成调控的重要位点。本文的研究对象FliT是在蛋白水平上调控FlhDC功能的蛋白。
　　FliT是一种鞭毛特异性的分子伴侣，它能特异性地结合FliD，一方面抑制FliD在细胞质中的聚沉，另一方面促进FliD的运输。FliT还可以和FlhDC复合体相互作用，抑制鞭毛基因的表达。
　　本论文的主要研究内容和结论如下:
　　(1)确定FliD与FliT作用的最小区域。为了找到与FliT相互作用的最小FliD片段，我们克隆了四个FliD片段:FliD1-115aa、FliD1-215aa、FliD115-end、215-end。通过pulldown，我们将与FliT作用的区域确定为FliDC端的210个氨基酸残基。
　　(2)获得FliT与FliD的蛋白复合物晶体。我们共转了FliT94与FliD(215-end)，得到含有可同时表达FliD和FliT蛋白的菌株。通过离子交换柱、分子筛纯化蛋白，冰上用胰蛋白酶消化蛋白复合体30min，筛晶体得到了FliT与FliD的蛋白复合物晶体。
　　(3)确定FliT与FliD、FlhDC作用的氨基酸。我们克隆了FliT的5个点突变体:F7S、W11S、W30S、Y40S、Y67S。通过pulldown，我们发现W30S突变体不能再和FliD结合，由此，我们得知FliT30位的色氨酸参与其与FliD的相互作用。用同样的方法，我们遗憾地发现5个点突变体都还能继续与FlhDC结合。
　　本课题的另一部分是关于大肠杆菌O157∶H7中Z0021蛋白结构和功能的研究。大肠杆菌O157∶H7是一种胃肠病原体，能引发人体多种疾病。Z0021基因位于OI-1菌毛编码区，是一种新发现的鞭毛合成抑制因子。敲除Z0021基因后，大肠杆菌O157∶H7细菌表面鞭毛数量增加，移动性显著增强。相反，如果过表达Z0021基因，就会抑制细菌移动。通用转录报告系统，发现Z0021蛋白不影响FlhDC的转录翻译，但影响二级三级基因的转录。在Z0021过表达的菌株中，FlhD4C2表达水平也随之上调。我们尝试通过纯化结晶的方法得到Z0021蛋白的结构，并解释其对细菌移动性的抑制机理。SignalP4.1Server预测发现Z0021的前18位氨基酸可能是信号肽。我们构建了Z0021-pGEX和Z0021-23-end-pGEX克隆，通过细菌移动性实验，我们发现Z0021的全长蛋白和片段23-end均能抑制细菌移动性。由此，我们推测Z0021发挥功能的区域可能是细胞质而非周质空间。