靶向微管新结构双吲哚马来酰亚胺化合物HD-ZWM-288抗肿瘤作用的研究

摘要

恶性肿瘤是当今危害人类健康甚至危及生命的主要疾病之一，其发病率逐年上升。乳腺癌和肝癌都是十分常见的恶性肿瘤，因其具有易转移并且易产生耐药性等特点，使得寻找毒性低同时疗效好的新型化疗药物也成为目前肿瘤治疗方面的一个重要的研究方向。中国海洋大学朱伟明课题组在从海洋微生物中发现抗肿瘤活性的新吲哚咔巴唑生物碱的基础上，开展了对双吲哚马来酰亚胺类生物碱结构修饰和构效关系的研究工作，设计并合成了一系列双吲哚马来酰亚胺类化合物，它们是一类具有烷基和腈基链的取代的结构。我们的前期研究已表明这些化合物能够抑制多株肿瘤细胞的生长。本文在发现HD-ZWM-288靶向微管的基础上，深入研究了其微管介导的抗肿瘤作用机制。
　　在对化合物筛选中，我们发现HD-ZWM-288有抑制微管的作用。以MCF-7细胞株和MDA-MB-231细胞株为研究对象，MTT法检测了HD-ZWM-288对它们的生长抑制作用，并呈现出时间和剂量的依赖性。我们建立了裸鼠皮下移植瘤模型，连续给药两周，结果表明HD-ZWM-288体内也能够抑制肿瘤生长。免疫荧光染色、Western Blot和免疫组化染色实验的结果均表明，HD-ZWM-288在体内和体外都具有抑制微管蛋白的作用。用流式检测发现化合物处理后的细胞被阻滞在G2/M周期。延长给药时间，通过DAPI染色和AnnexinⅤ和PI双染这些手段发现与对照组相比加入了HD-ZWM-288后的细胞皱缩、染色质聚集和凋亡率增加，这些结果提示该化合物最终可能通过细胞凋亡的方式诱导细胞死亡。综上所述，HD-ZWM-288抑制乳腺癌细胞增殖，首先它抑制微管蛋白聚合，导致cdc2、p-cdc2蛋白表达下降，使细胞停滞于G2/M期，进一步抑制增殖，最终导致细胞凋亡。
　　肝癌的发生与恶化与细胞本身的增殖、凋亡和分化三者之间达成的平衡失稳息息相关。通过MTT法检测的结果显示HD-ZWM-288能够抑制HepG-2细胞株的增殖。同样建立裸鼠单侧腋下皮下HepG-2移植瘤模型，结果证明在体内它也能抑制HepG-2移植瘤生长。通过流式细胞术检测，发现HD-ZWM-288可以诱导HepG-2凋亡并且使细胞停滞在G2/M期。采用DAPI染色同样发现化合物处理细胞后出现典型的凋亡特点。Western Blot检测结果表明cyclinB1的蛋白表达水平增加，cdc2和p-cdc2的蛋白表达水平下降，进一步证明G2/M期阻滞是由于HD-ZWM-288影响细胞的周期相关蛋白导致的。选用Western Blot检测加药后磷酸化H2AX的表达变化，表明化合物作用后出现了DNA双链断裂。在HD-ZWM-288诱导HepG-2细胞凋亡的信号转导途径中，我们还发现化合物作用于细胞后ROS的显著增加，Bcl-2/Bax这两者的蛋白表达率显著降低，线粒体膜电势崩溃和细胞色素C释放，进而激活了caspase-9，caspase-3和PARP这一级联反应，最终导致细胞凋亡。综上所述，HD-ZWM-288首先造成HepG-2细胞DNA损伤，进一步导致细胞周期阻滞，无法修复损伤的细胞则启动了线粒体途径的凋亡。
　　血管生成是肿瘤的发生、生长以及转移过程当中必不可少的关键所在。MTT结果说明HD-ZWM-288能抑制血管内皮细胞HUVEC的生长。进一步研究发现，在较低剂量下，化合物对迁移和管形成有明显的抑制作用。此外，还采用鸡胚尿囊膜实验和建立的裸鼠皮下移植瘤模型对化合物的抗新生血管作用进行评价。CAM和免疫组织化学实验结果均表明HD-ZWM-288在体内也可以有效地发挥抑制血管生成的作用。在转录和翻译水平上检测了在血管形成中起到重要作用的分子和相关通路，结果表明HD-ZWM-288的抗新生血管作用可能与其抑制VEGF信号通路和其下游的ERK1/2和Akt通路活性有关。
　　本课题首次对HD-ZWM-288，这一双吲哚马来酰亚胺类的生物碱进行抗癌活性和机制的探究。结果表明该化合物通过多方面机制发挥其抗肿瘤作用，并且体内有效，以上结果表明HD-ZWM-288是一个具有发展潜力的抗肿瘤先导化合物，我们的研究也为其今后的进一步研究与开发提供理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

绪论

参考文献

第一章 HD-ZWM-288靶向微管抗肿瘤活性及其机制的研究

1．1 前言

1．2 实验材料

1．3 试验方法

1．4 实验结果

1．5 讨论

参考文献

第二章 HD-ZWM-288诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究

2．1 前言

2．2 实验材料

2．3 试验方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

参考文献

第三章 HD-ZWM-288抗新生血管活性及其机制的研究

3．1 前言

3．2 实验材料

3．3 试验方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

参考文献

结论

致谢

攻读学位期间发表的论文