靶向微管双吲哚类化合物的筛选及HD-ZWM-288抗肿瘤多药耐药的研究

摘要

近年来，全球新发癌症病例及死亡人数逐年上升。由于微管在有丝分裂事件中的作用，其已经是医学上经过验证的化疗药物的靶点。我们首先对基于微管靶点的化合物进行筛选，所采用的双吲哚类化合物是在从海洋微生物中发现的具有良好抗癌生物活性的新吲哚咔巴唑生物碱的基础上，对已有的双吲哚类化合物进行修饰和改造得到的。
　　在前期工作的基础上，我们最终选用这十五个化合物进行微管作用的筛选。我们对首先分析实验中的十五个化合物对细胞周期的作用。结果显示，大部分所选用的双吲哚类化合物都有不同程度的周期阻滞作用。其中，在具有G2/M期阻滞作用的化合物中，HD-ZWM-288,HD-ZWM-597的作用最强。因此，我们推测HD-ZWM-288,HD-ZWM-597可能具有靶向微管的抗肿瘤活性。但由于HD-ZWM-597在体外实验中毒性较大，HD-ZWM-288作为候选先导物进行深入的体内外靶向微管的抗肿瘤作用及其机制的研究。对HD-ZWM-288进行计算机拟合分析，结果显示HD-ZWM-288与靶点有非常好的对接。鉴于以上的实验结果，我们推测HD-ZWM-288具有较好的靶向微管药物的潜力，后续的试验及机制的研究由李琳师姐完成，并且后续的研究表明，HD-ZWM-288确实具有良好的靶向微管的抗肿瘤的作用。
　　但是，大多数微管抑制剂的副作用较大，并且使用过程中较易出现耐药性。因此，急需开发活性更强、副作用较小，并且对多药耐药细胞也有效的新型微管抑制剂。在对化合物HD-ZWM-288的抗肿瘤的机制研究过程中，我们发现其具有较好的抗多药耐药的作用。
　　MTT实验结果表明，相对于阿霉素和长春新碱，HD-ZWM-288对MDR细胞表现出有效的细胞毒性，尤其对K562/A02及K562这一组细胞作用最明显。而对正常细胞具有较小的细胞毒性。不同浓度HD-ZWM-288作用的K562/A02及K562细胞12h，在显微镜下可以观察到细胞膜皱缩，细胞裂解成碎片等形态变化。AnnexinⅤ/PI双染法以及Western blot结果表明，HD-ZWM-288可以诱导K562/A02及K562细胞产生凋亡。
　　MDR的产生机制中最常见的是ATP结合膜转运蛋白家族过量表达诱发细胞外排作用增强。流式细胞仪分析结果说明，在HD-ZWM-288可以诱导K562/A02及K562细胞内的罗丹明的积累量呈浓度依赖性增加。Western Blot及实时定量PCR实验说明HD-ZWM-288可以抑制P-gp的表达及转录水平。基于这些实验结果，HD-ZWM-288是通过有效地抑制P-gp的作用，促进细胞内药物的积累量，诱导耐药肿瘤细胞细胞凋亡。
　　影响P-gp表达的信号通路主要有ROS、MAPK、PI3K/AKT、及NF-κB信号通路。在本研究中，HD-ZWM-288可以诱导细胞内ROS的水平升高，线粒体膜电位下降，以及细胞色素C的释放。这些试验结果说明，HD-ZWM-288可能是通过ROS的产生来影响Bcl-2和Bax的表达，从而引起细胞凋亡。作为ROS的下游信号，MAPK与肿瘤的耐药性息息相关。在本研究中，HD-ZWM-288可以显著降低ERK/MAPK通路的表达水平，增加P38/MAPK通路的表达水平，增加了JNK/SAPK通路的表达水平。根据这些实验结果，我们推测HD-ZWM-288的抑制耐药细胞生长活性与其调节的这些蛋白激酶有关。
　　MDR1启动子区域存在着NF-κB的结合序列，NF-κB能够激活连接MDR1启动子的基因转录。AKT是NF-κB的上游信号，可以调控NF-κB的表达。在本研究中，HD-ZWM-288可以显著抑制AKT的磷酸化，增加IκBα的表达，进而降氐NF-κB的磷酸化。这些实验结果表明，AKT/NF-κB信号通路也参与了HD-ZWM-288引起的P-gp的表达降低。
　　在本实验中我们发现HD-ZWM-288在细胞发生明显的凋亡之前可以引起明显的G2/M期阻滞。为了验证ROS是否参与HD-ZWM-288引起的细胞周期阻滞，我们用ROS清除剂NAC提前处理细胞。结果显示，在NAC的作用下，可以逆转HD-ZWM-288引起的G2/M期阻滞。以上这些实验结果说明，ROS是也参与HD-ZWM-288引起的细胞周期阻滞。
　　综上所述，HD-ZWM-288具有较好的抗肿瘤多药耐药作用。在HD-ZWM-288的作用下，细胞内ROS水平升高，一方面降低Bcl-2的表达，激活Bax蛋白家族，从而使线粒体膜电位下降，线粒体膜破裂，细胞色素C释放，进而引起细胞凋亡。另一方面通过作用于MAPK和AKT/NF-κB信号通路，抑制P-gp的表达，进而增加细胞内药物积累量，引起细胞凋亡。同时HD-ZWM-288在引起细胞凋亡之前还会引起G2/M期阻滞，ROS也参与了这一过程。以上结果表明，HD-ZWM-288是一个具有发展潜力的抗肿瘤多药耐药先到化合物，我们的研究也为其今后的进一步研究与开发提供了理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

第一章 绪论

1．1 肿瘤的化学治疗与多药耐药

1．2 多药耐药及其产生机制

1．3 P-gp概述

1．4 微管

1．4．1 微管蛋白的结构与功能

1．4．2 靶向微管的药物

1．4．3 微管与细胞周期

1．5 ROS的产生与细胞凋亡

1．6 ROS-MAPK信号通路与多药耐药

1．7 AKT／NF-κB信号通路与多药耐药

第二章 靶向微管双吲哚类化合物的筛选

2．1 实验材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 化合物

2．1．3 实验试剂及配置

2．1．4 实验仪器及设备

2．2 实验方法

2．2．1 细胞复苏及培养

2．2．2 细胞周期检测

2．3 实验结果

2．3．1 双吲哚类化合物对MDA-MB-231细胞周期的作用

2．3．2 计算机靶点对接试验

2．4 讨论

第三章 HD-ZWM-288抗肿瘤多药耐药活性的研究

3．1 实验材料

3．1．1 细胞株

3．1．2 化合物

3．1．3 实验试剂及配置

3．1．4 实验仪器及设备

3．2 实验方法

3．2．1 细胞复苏及培养

3．2．2 细胞周期检测

3．2．3 MTT法检测药物细胞毒性

3．2．4 Annexin V-PI双染检测细胞凋亡

3．2．5 细胞总蛋白提取

3．2．6 亚细胞蛋白分离提取

3．2．7 蛋白定量

3．2．8 Western Blot电泳分析

3．2．9 活性氧检测

3．2．10 线粒体膜电势的检测

3．2．11 RNA提取与Real-time PCR

3．12 P-gp测定

3．13 罗丹明123积累

3．3 实验结果

3．3．1 多药耐药细胞株耐药性的确定

3．3．2 HD-ZWM-288体外抗肿瘤多药耐药活性检测

3．3．3 HD-ZWM-288诱导耐药肿瘤细胞凋亡的作用

3．3．4 HD-ZWM-288对P-gp作用的实验研究

3．3．5 HD-ZWM-288诱导细胞内ROS升高

3．3．6 HD-ZWM-288诱导线粒体膜电位下降及细胞色素C的释放

3．3．7 HD-ZWM-288上调Bax／Bcl-2比例

3．3．8 HD-ZWM-288抗多药耐药分子机制

3．3．9 HD-ZWM-288对耐药细胞周期的影响

3．4 讨论

总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文