新型载体前药透明质酸苯丁酸酯的合成、表征及活性研究

摘要

癌症治疗常因药物缺乏肿瘤细胞特异识别能力，对人体正常组织伤害较大。肿瘤靶向给药体系的研究正是为了提高药物作用的靶向性，增强药效，降低毒副作用。透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)是一种天然的糖胺聚糖，具有高度黏弹性、可塑性、非免疫原性、良好的生物相容性及可降解性等优良特性，现已成为药物递送研究的热点。HA既可以作为药物的大分子载体，又可与多种细胞表面受体特异性结合，其中最主要的受体CD44高表达于肿瘤细胞表面。利用该特性，HA可靶向递送抗肿瘤药物至肿瘤组织和细胞内，提高药物对肿瘤细胞作用的有效性，减少用药剂量，降低不良反应。除此之外，HA作为载体能够利用肿瘤组织的高通透性及滞留性，聚集在肿瘤组织中，增强靶向性。苯丁酸(PhenylbutyrateAcid，PBA)是芳香脂肪酸结构化合物，可较为方便地与透明质酸双糖单位上羟基发生酯化反应，适合作为模型药连接至HA。PBA对肿瘤细胞株具有广谱诱导能力，可通过多种调控方式促使肿瘤细胞向正常细胞分化成熟，促进白细胞聚集，改变肿瘤的免疫原性。PBA与载体结合形成载体前药，有利于PBA在靶点周围聚集，在体内逐渐释放，达到缓释及靶向给药作用。
　　本文选用透明质酸作为药物载体，与抗肿瘤药物苯丁酸酯化结合，设计成新型载体前药透明质酸苯丁酸酯(HA-PB)，主要研究结果如下。
　　1.本论文首次介绍了新型载体前药透明质酸苯丁酸酯的合成路线，将苯丁酸活化后连接到透明质酸6位羟基上，改变反应条件得到系列酯化产物，最终优化反应条件得到具有良好水溶性的140404、140426、140428批次HA-PB。
　　2.通过红外、核磁、紫外对HA-PB进行结构表征。在红外图谱中，HA-PB在1735 cm-1处出现新的酯键吸收峰，表明反应有酯键生成;核磁结果中，对140404、140426、140428批次HA-PB的核磁化学位移归属，确定由PB引入的苯环区域在低场δ7.29 ppm出现，并分别对图中PB苯环和HA酰胺甲基积分，计算得到三个产物的酯化度分别为13.2％、21.8％和34.4％。
　　3.建立HPLC方法对合成产物HA-PB进行有关物质分析。通过保留时间对照法对有关物质进行定性，并分别作出有关物质的标准曲线，对每个有关物质成分进行定量分析，计算出HA-PB的纯度均＞99.0％。然后通过加碱降解法，充分测定HA-PB中PB含量，计算产物酯化度为17.1％、21.8％、30.3％，与核磁法测出结果基本一致，具有较高可信度。
　　4.设置正常组、阴性对照组、阳性对照组、实验组，观察加药培养液作用于小鼠黑色素瘤细胞(B16)后，细胞形态学变化，初步观察发现抑制能力与酯化度大小成正比关系。通过MTT比色法考察HA-PB对小鼠黑色素瘤细胞(B16)的体外抑制活性。结果表明，140404、140426、140428批次HA-PB对B16细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为0.199、0.013、0.017 mmol/L（PB当量），均低于PB的IC50值1.277 mmol/L。初步判断HA-PB的癌细胞抑制作用较原药PB有了增强。

目录

声明

摘要

符号说明

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 透明质酸

1．2．1 透明质酸结构特性

1．2．2 透明质酸及其衍生物作为药物载体的研究进展

1．2．3 透明质酸与CD44受体

1．2．4 以透明质酸为载体的抗肿瘤前体药物研究进展

1．3 苯丁酸

1．3．1 苯丁酸结构及抗肿瘤活性研究进展

1．3．2 苯丁酸抗肿瘤活性机制

1．4 本论文研究内容

第2章 新型载体前药透明质酸苯丁酸酯合成

2．1 材料与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 透明质酸苯丁酸酯合成路线设计

2．2．2 透明质酸十六烷基三甲基铵盐(HA-CTA)的制备

2．2．3 苯丁酸活化

2．2．4 透明质酸苯丁酸酯的合成

2．3 实验结果

2．3．1 合成产物

2．3．2 性状观察

2．4 讨论

第3章 透明质酸苯丁酸酯结构表征及酯化度确定

3．1 材料与仪器

3．2 实验方法

3．2．1 红外光谱(FT-IR)表征

3．2．2 核磁共振氢谱表征及酯化度确定

3．2．3 紫外吸光度法表征及产物中苯丁酸含量测定

3．3 实验结果

3．3．1 红外光谱(FT-IR)表征结果

3．3．2 核磁共振氢谱(1H-NMR)表征及酯化度确定

3．3．3 紫外吸光度法(UV)表征结果

3．4 讨论

第4章 HPLC法测定透明质酸苯丁酸酯纯度及酯化度

4．1 材料与仪器

4．2 实验方法

4．2．1 色谱条件的建立

4．2．2 供试品溶液的配制

4．2．3 有关物质定性方法

4．2．4 标准曲线的建立

4．2．5 HPLC法测定HA-PB纯度

4．2．6 HPLC法测定HA-PB酯化度

4．2．7 方法学考察

4．3 实验结果

4．3．1 有关物质定性结果

4．3．2 标准曲线建立结果

4．3．3 HPLC法HA-PB纯度测定结果

4．3．4 HPLC法HA-PB酯化度测定结果

4．3．5 方法学考察结果

4．4 讨论

第5章 透明质酸苯丁酸酯前药体外抑癌活性研究

5．1 材料与仪器

5．2 实验方法

5．2．1 小鼠黑色素瘤细胞(B16)培养

5．2．2 实验药液的配制

5．2．3 细胞形态学观察

5．2．4 MTT法检测抑制率

5．3 实验结果

5．3．1 细胞形态学观察

5．3．2 抑癌活性评价结果

5．4 讨论

总结与展望

参考文献

致谢

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