慢性肾衰竭大鼠早期脂肪沉积的动态变化及核心蛋白聚糖基因治疗

摘要

目的:
　　本研究主要探讨早期肾衰竭大鼠主动脉脂肪沉积及血液中脂肪谱浓度变化，及其引发心血管并发症的机制;分子水平阐明核心蛋白聚糖基因治疗慢性肾衰竭的疗效，以及是否能够防治并发的脂质代谢紊乱、心血管并发症，探讨可能的机制。
　　方法:
　　1.实验动物准备与分组
　　共186只成年SD大鼠，96只雄性，90只雌性，均购自山东大学实验室动物中心，体重约150g-200g。在无菌条件下应用两步法，行5/6肾切除手术制造肾衰竭大鼠模型。假手术组仅仅切开腹腔，再立即缝合，保留肾脏。两部分实验入组大鼠共168只，其余18只根据需要，同等条件制造相应模型，作为意外死亡大鼠的补充。
　　2.相关指标的检测
　　2.1第一部分实验
　　2.1.1实验分组:
　　实验组，接受真正的两步法行5/6肾切除手术制造肾衰竭大鼠模型，n=24;对照组，仅仅接受手术切开腹腔皮肤，但保留肾脏，即假手术组，n=24。分别在第0天、第10天、第30天、第60天处死6只大鼠，用于取主动脉弓检测脂肪沉积情况。第40天时不处死，仅抽血。
　　2.1.2血浆、红细胞膜及主动脉弓脂肪的动态变化
　　采集检测第0天、第10天、第20天、第40天和第60天五个时间点的红细胞膜磷脂的动态变化。
　　采集检测第0天、第10天、第30天、第60天血浆甘油三酯、总胆固醇、磷脂的动态浓度变化，以及主动脉弓脂肪的动态变化。
　　其中血浆甘油三酯的检测采用甘油-3-磷酸氧化-苯酚-氨基比林法（PAP法），总胆固醇采用钼酸铵还原法，红细胞膜脂肪、主动脉脂肪均先采用Rose-Gottlieb提取法提取出脂肪，其后甘油三酯仍采用PAP法，总胆固醇采用钼酸铵还原法，磷脂则采用酸消化后，采用钼蓝比色法先检测出无机磷浓度，在采用无机磷与磷脂的换算系数计算得出。其他生化指标如血肌酐则采用PAP比率法。
　　2.2第二部分实验
　　2.2.1实验分组
　　A组，30只大鼠，行假手术，保留肾脏;其余均接受真手术制造肾衰竭大鼠模型。所有大鼠在手术后均可自由进饮食;等到真手术组大鼠肾衰竭模型建立成功，则进一步随机分组，1）B组，手术对照组，不接受任何治疗，n=30;2）C组，空白治疗对照组，仅仅接受空白载体转染的成纤维细胞[FB(LXSN)cells]治疗，n=30;3）D组，治疗组，接受核心蛋白聚糖载体转染的成纤维细胞[FB(LDCNSN)cells]治疗，n=30。分别在第0天、第10天、第20天、第30天、第60天每组处死6只大鼠，用于取肾脏组织、主动脉弓。第40天时只抽血，不处死。
　　2.2.2显微镜观察肾脏病理变化
　　观察第0天、第30天、第60天三个时间点肾小球硬化、肾间质纤维化的变化。采用HE、PAS、Masson染色等应用普通光镜观察肾脏病理变化，采用半定量分级法:0，正常;Ⅰ，肾脏病变（肾小球硬化、肾间质纤维化）≤30％;Ⅱ，肾脏病变（肾小球硬化、肾间质纤维化）31-60％;Ⅲ，肾脏病变（肾小球硬化、肾间质纤维化）≥61％。
　　2.2.3成纤维细胞的培养及注射
　　FB(LDCNSN)和FB(LXSN)细胞均在改良的良伊格尔DMEM细胞培养基（含300ng/ml的G418与10％的胎牛血清）中孵育培养。DCN转染的载体导入FB细胞，培养成FB(LDCNSN)细胞，空白载体导入FB细胞，培养成FB(LXSN)细胞，后应用乙二胺四乙酸-胰蛋白酶消化收集，然后应用高压无菌生理盐水冲洗3次。将细胞浓度调整到1X106/ml，采用多点注射法注射到肾髓质，使之达到约1X106/肾的注射量。
　　2.2.4甘油三酯、总胆固醇、总磷脂、血肌酐、尿素氮的测定
　　均采集检测第0天、第10天、第20天、第30天和第60天五个时间点的红细胞膜总胆固醇、总磷脂的动态变化。
　　均采集检测第0天、第10天、第20天、第30天、第60天血脂及主动脉弓脂肪的动态变化。
　　均采集检测第0天、第10天、第20天、第30天和第60天五个时间点的血肌酐、尿素氮的动态变化。
　　其中血浆甘油三酯的检测采用甘油-3-磷酸氧化-苯酚-氨基比林法（PAP法），总胆固醇采用钼酸铵还原法，红细胞膜脂肪、主动脉脂肪均先采用Rose-Gottlieb提取法提取出脂肪，其后甘油三酯仍采用PAP法，总胆固醇采用钼酸铵还原法，磷脂则采用酸消化后，采用钼蓝比色法先检测出无机磷浓度，在采用无机磷与磷脂的换算系数计算得出。其他生化指标如血肌酐则采用PAP比率法。
　　2.2.5肾组织中核心蛋白聚糖(DCN)与转化生长因子β1(TGF-β1)的检测
　　检测第0天、第30天、第60天三个时间点二者在肾组织中表达的动态变化。EnVisionTM免疫组化系统用于检测肾组织中的DCN与TGF-β1的表达。
　　具体过程:脱蜡、微波修复抗原10min、每个玻片加1滴3％双氧水、室温孵育20min、加一抗(兔抗鼠单克隆抗TGF-β1抗体、兔抗鼠单克隆抗DCN)、1∶200稀释、室温孵育2h，磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗5minX3次、加抗生物素蛋白、室温孵育20min、PBS漂洗3min、加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，、室温孵育30min、PBS漂洗5minX3次、加3，3'-二氨基联苯胺、光镜观察5min、加用苏木精复染和01.％盐酸保存、流动水水冲洗、显蓝色、乙醇梯度脱水、加二甲苯、树胶封片、空气风干。
　　观察DCN与TGF-β1的表达，采用半定量观察其分布法:0，没有染色;1，偶然有染色;2，局灶性染色;3，弥漫性染色。
　　3.统计分析
　　采用SPSS17.0统计软件分析，计量数值以x±s表示，根据需要选用配对资料的t检验或单因素方差分析及线性相关分析进行统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.第一部分实验结果
　　实验组BUN和Scr浓度在第10天达到最高(分别为26.56±2.16 mmol/l和308.50±15.73μmol/l)。浓度在第20天开始下降，第40天值最低（分别为16.22±3.57mmol/l和193.45±20.32μmol/l）;不过，这两个时间点的浓度都比对照组的要高（分别为7.89±2.58 mmol/l和91.22±19.73μmol/l）(P＜0.01)。BUN和Scr浓度在第60天再次升高。
　　实验组主动脉弓三种脂肪成分甘油三酯、总胆固醇、磷脂均在第10天时呈现上升趋势，甘油三酯在第30天、60天时明显高于对照组(P＜0.05，P＜0.01)。总胆固醇、总磷脂在第10天时开始升高，在第60天时明显高于对照组(P＜0.01，P＜0.05)。血浆TG和T-Ch水平与主动脉组织中相应脂质水平显著正相关(r=0.944和r=0.937)，而血浆T-PL水平刚与主动脉组织中T-PL水平显著负相关(r=-0.832)。
　　实验组血浆中甘油三酯、总胆固醇均在第10天开始升高，并持续升高，在第10天、第30天、第40天、第60天时均高于对照组(P＜0.05)。总磷脂在第10天时明显升高，然后在第20天、30天时降低，在第60天时复又开始轻度升高。
　　实验组红细胞膜总胆固醇在第10天开始升高，在第40天、60天时明显高于对照组(P＜0.05)，红细胞膜总磷脂在第20天时较对照组轻度降低(P＜0.05)，在第40天、60天时则较对照组明显降低(P＜0.01)。红细胞膜中T-Ch的水平与血浆T-Ch水平显著正相关(r=0.946)。
　　2.第二部分实验结果
　　采用核心蛋白聚糖治疗干预后，D组在第10天之后的各时间点血尿素氮、血肌酐均较B组与C组上升幅度明显变小(P＜0.05)，但仍较A组上升(P＜0.05)。D组在第30天和第60天DCN在肾组织中表达较B组、C组均明显增加(P＜0.01)。D组中TGF-β1表达在第30天和第60天则较B、C组均有所减少(P＜0.05)，但仍较A组仍明显增加(P＜0.05)，B组、C组与本组第0天及A组比较亦明显增加(P＜0.01)
　　采用核心蛋白聚糖治疗干预后，D组在第30天、60天血脂成分升高幅度均低于B组与C组(P＜0.01)，亦较A组升高，差异程度小于与B组及C组的差异(P＜0.05)，主动脉弓血脂变化与血脂类似，D组红细胞膜总胆固醇在第20天开始升高，在第30天、60天明显升高，但升高幅度均小于B组与C组(P＜0.05)，磷脂则在第20天开始降低，第30天、60天时明显降低，降低幅度亦明显小于B组与C组(P＜0.05)。
　　结论:
　　早期慢性肾衰竭大鼠血脂升高，主动脉脂肪沉积增加，发生动脉粥样硬化风险增加。红细胞膜胆固醇增加，磷脂降低，膜的僵硬程度增加，变形能力变差。
　　应用核心蛋白聚糖基因治疗后，不但能延缓肾衰竭的恶化进展，改善其肾功能，而且能够减轻其血脂紊乱，从而可能延缓动脉粥样硬化性心血管并发症的发生、发展，改善预后.

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分

材料与仪器及方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

综述 慢性肾功能衰竭的脂代谢紊乱及核心蛋白聚糖治疗进展

致谢

攻读学位期间发表论文目

学位论文评阅及答辩情况表

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