claudin-1与cyclinB1在下咽癌中的表达及其临床意义

摘要

发现claudin-1和cylinB1在下咽鳞状细胞癌组织中的表达水平、与肿瘤临床分期、病理学分级、患者临床预后之间的相关性尚有待研究;claudin-1蛋白与下咽癌微淋巴管生成是否相关尚不清楚。本研究采用免疫组化和实时定量PCR的方法，测定claudin-1和cyclinB1在下咽癌组织及癌旁组织中的表达情况，分析claudin-1和cyclinB1与下咽鳞癌的临床病理特征之间的关系，同时分析它们与患者预后之间的关系，采用免疫组化的方法检测D2-40标记的微淋巴管密度，研究claudin-1蛋白与下咽鳞癌淋巴管生成的关系，以期为下咽癌的早期诊断和预后判断提供分子生物学指标，为寻求肿瘤靶向治疗提供研究方向，同时应用体外实验通过沉默claudin-1观察对FaDu细胞增殖及侵袭的影响，进一步研究claudin-1的生物学特性。
　　第一部分 claudin-1与cyclinB1在下咽癌中的表达及其临床意义
　　下咽鳞状细胞癌的发病率虽然较低，但因原发肿瘤位置隐蔽，不易发现，多数下咽癌患者在就诊时已经是晚期，往往已发生临近部位侵犯和颈部淋巴结转移，患者预后较差。claudin-1属于claudins蛋白家族成员之一，在多种肿瘤中出现异常表达，目前研究表明，这种异常表达与肿瘤的发生、发展有关;cyclinB1是一个经典的细胞周期蛋白，目前发现cyclinB1失控性的表达与肿瘤细胞的转化和恶性增殖密切相关。但是claudin-1与cyclinB1在下咽鳞癌中的表达还罕有报道。因此，我们首先研究claudin-1与cyclinB1在下咽鳞癌及癌旁组织中的表达情况，分析claudin-1和cyclinB1与下咽鳞癌的临床病理特征之间的关系，同时分析它们与患者预后之间的关系。
　　目的与方法:
　　1、选取97例具有完整临床病理资料的下咽鳞癌患者的组织学标本为研究对象，并选取90例癌旁正常黏膜组织作为对照，采用免疫组化的方法从蛋白水平比较claudin-1和cyclinB1在下咽鳞癌及正常黏膜组织中的表达的差异，分析两者在下咽鳞癌中的表达与临床病理参数及患者预后之间的关系。
　　2、选取30位下咽癌病人术后的癌组织及癌旁正常黏膜，采用RT-PCR方法，在mRNA水平检测claudin-1和cyclinB1的表达并定量分析，探讨两者的相关性。
　　结果:
　　1、claudin-1与cyclinB1在下咽癌中均为高表达;claudin-1蛋白表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移有关;cyclinB1蛋白表达与肿瘤的分化程度有关;而与其他临床病理资料无明显相关性。Kaplan-Meier分析显示claudin-1与患者的生存率相关(P=0.003)。claudin-1与cyclinB1呈明显正相关关系。
　　2、claudin-1 mRNA和cyclinB1mRNA在下咽癌组织中的表达量均高于癌旁黏膜组织中的表达量。Spearman等级分析结果显示在肿瘤组织和癌旁黏膜组织中claudin-1mRNA与cyclinB1mRNA之间存在明显正相关关系。
　　结论:
　　(1)claudin-1在下咽鳞状细胞癌组织中呈高表达，且与肿瘤的分化程度和淋巴结转移有关;并与患者的生存率相关，claudin-1低表达者有较高的生存率。
　　(2)cyclinB1在下咽鳞状细胞癌组织中亦呈高表达，并与肿瘤的分化程度有关，与患者的生存率无关。
　　(3)claudin-1和cyclinB1在下咽鳞状细胞癌组织中的表达具有显著正相关关系。
　　第二部分 claudin-1蛋白与下咽癌微淋巴管密度的关系研究
　　下咽鳞癌发生部位比较隐匿，同时下咽部有丰富的淋巴管网，容易较早出现颈部淋巴结转移，临床分期N1-N3患者颈部淋巴结转移率为65％-80％，目前认为，颈部淋巴结转移成为下咽癌治疗失败的主要原因之一，严重影响了患者的预后。恶性肿瘤的重要特性包括浸润和转移，而多数肿瘤通过淋巴管发生转移，目前认为淋巴管的生成在肿瘤的生长、侵袭及转移过程中发挥了极其重要的作用。微淋巴管密度(microlymphatic vessel density，MLVD)成为评估恶性肿瘤转移与预后的重要因子。D2-40被认为是目前发现的最具有特异性的淋巴管标记物，广泛的应用于肿瘤微淋巴管生成的研究，我们前期研究中证实下咽鳞状细胞癌中claudin-1蛋白表达情况与肿瘤淋巴结转移有关。但claudin-1蛋白与下咽癌微淋巴管生成是否相关尚不清楚，是否通过微淋巴管生成导致了淋巴结的转移尚待研究;本研究通过研究claudin-1蛋白与下咽鳞癌淋巴管生成的关系，探讨下咽鳞癌淋巴转移的机制。
　　目的与方法:
　　选取97例具有完整临床病理资料的下咽鳞癌患者的组织学标本为研究对象，并选取90例癌旁正常黏膜组织作为对照，采用免疫组化的方法检测claudin-1和微淋巴管密度在下咽鳞癌及正常黏膜组织中的表达，分析微淋巴管密度与下咽鳞癌临床病理资料的关系，分析claudin-1和微淋巴管密度在下咽鳞癌及正常黏膜组织中表达的相关性，从而探讨下咽鳞癌淋巴转移的机制。
　　结果:
　　1、下咽鳞癌中，癌巢周边区的微淋巴管(MLVD)数目显著高于癌巢中心区微淋巴管数目(MLVD)及癌旁正常粘膜组织中MLVD，两者间差异均有统计学意义（P＜0.05）;而癌巢中心区MLVD与癌旁正常粘膜组织中MLVD相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　2、癌巢中心区的MLVD与患者各临床指标进行相关分析均无统计学意义（P＞0.05）。癌巢周边区的MLVD与组织病理学分级、临床分期和淋巴结转移等指标显著相关，分析均有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、癌巢中心区的claudin-1表达阳性组的MLVD与阴性组相比差异无统计学意义，癌巢周边区claudin-1表达阳性MLVD与阴性组MLVD相比有统计学意义(P＜0.05)，相关分析表明在下咽鳞癌癌巢周边区中claudin-1表达与MLVD之间呈正相关表达。
　　结论:
　　1、下咽癌癌巢周边区微淋巴管密度和淋巴结转移相关（P＜0.05），提示癌巢周边区微淋巴管可能促进了局部淋巴结的转移。
　　2、claudin-1阳性表达和阴性表达在癌巢周边区的微淋巴管密度存在差异，提示高表达claudin-1可能会诱导肿瘤淋巴管生成，从而促进淋巴结转移。
　　第三部分 沉默claudin-1在体外对细胞增殖及侵袭的影响
　　我们在前期研究中发现，claudin-1在下咽鳞状细胞癌中呈现高表达，与细胞分化及淋巴结转移相关，且claudin-1mRNA在下咽癌细胞中的含量增高，考虑claudin-1在下咽鳞癌中起了促进肿瘤细胞增殖及局部侵袭转移的功能，因此我们通过体外实验，在FaDu细胞系中通过沉默claudin-1观察FaDu细胞增殖及侵袭能力的变化，从而进一步研究claudin-1的生物学特性。
　　目的与方法:
　　通过脂质体2000转染人咽癌细胞系(FaDu)沉默claudin-1，利用细胞培养技术进行增殖实验和侵袭实验。
　　结果:
　　1、培养的FaDu细胞增殖活力良好。
　　2、应用RNA干扰技术，沉默claudin-1后，FaDu-siRNA瞬时沉默的效果良好，经Western blot实验证实。
　　3、沉默claudin-1后，FaDu-siRNA（沉默组）、FaDu-control（阴性对照组）以及FaDu未处理组，三组细胞均出现了不同程度的增殖现象，三组的吸光值在48小时后，沉默组与阴性对照组及未处理组比较，细胞的增殖明显受影响，沉默组增殖能力降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而阴性对照组及未处理组之间比较，差异没有统计学意义（P＞0.05）。
　　4、侵袭实验表明:进入小室的细胞数，沉默组与阴性对照组及空白对照组分别为15±6.45、47±6.36、50±8.73，差异有统计学意义（P＜0.001);沉默claudin-1后，细胞的侵袭能力明显下降，FaDu-control以及FaDu未处理组比FaDu-siRNA组具有更强的侵袭能力。
　　结论:体外实验显示claudin-1能促进下咽癌细胞的增殖、黏附及侵袭。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 claudin-1与cyclinB1在下咽癌中的表达及其临床意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 claudin-1蛋白与下咽癌微淋巴管密度的关系研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 沉默claudin-1在体外对细胞增殖及侵袭的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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