纺锤链霉菌SD-07与突变株所产抗生素特性比较及其胞外多糖的初步研究

摘要

真菌感染在临床上波及范围广，常用的抗真菌药物有多烯大环内酯类、唑类、棘球白素类、丙烯胺类、嘧啶类，每种药物均存在一定的毒副作用，但研究发现多烯大环内酯类类相对于其它种类药物来说其毒副作用相对较低，同时也是临床上治疗真菌感染的最后用药。但长期大量使用同样具有导致肾功能衰竭和血栓性静脉炎的毒性，因此寻找更为低毒的抗生素显得尤为重要。
　　纺锤链霉菌（Streptomycese netropsis）SD-07是本实验室2007年发现的一株新型菌株，其所产抗生素为多烯大环内酯类抗生素，相比两性霉素B，它具有更强的抗真菌活性。SD-07具有两种高产突变株163和180，为验证三种菌株经过5年传代后菌株是否仍高产，抗生素结构及活性是否有变化，本论文对三种菌株所产抗生素进行产量和活性的比较，同时对不同的纯化方法进行了活性、稳定性和毒性比较。
　　本实验室在对链霉菌SD-07接合转移体系的建立过程中发现Ca2+能够极大地增加接合转移的频率，电镜下观察链霉菌SD-07菌体发现当Ca2+存在时其胞外多糖的产生量明显比不添加Ca2+时多。为更好的阐明胞外多糖与Ca2+以及接合转移之间的关系，本论文同时对SD-07胞外多糖的发酵和结构解析进行了相关研究。
　　研究结果如下:
　　1.抗生素相关研究结果
　　纺锤链霉菌SD-07的180突变株是抗生素高产菌株，163菌株次之，相对于原始菌株SD-07，180抗生素产量是其3.33倍，163菌株是其1.28倍。
　　高压液相(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、液相-质谱分析(liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS)和抑菌实验结果显示三种抗生素主要成分之间并无大的差别。
　　不同的制备方法表明萃取法所制备的抗生素活性最为稳定，分子筛所制备的抗生素最不稳定。
　　相隔三个月的抑菌性实验证明菌株180所产的抗生素粗品活性最高，随着时间的延长，抑菌活性增加，推测可能与溶解性有关。
　　就细胞毒性试验来讲中压液相层析(Fast Pressure Liquid Chromatography，FPLC)是一种提纯抗生素、降低毒性并提高抑菌性的好方法。
　　SOS/umu-1 acZ体系的致突变性检测结果表明链霉菌所产生抗生素的体外致突变性为阴性，并与突变株类型和制备方法无关。
　　2.胞外多糖相关研究结果
　　胞外多糖产量最高时所用发酵时间为48h，培养基为R2YE，Ca2+对多糖的产生有明显的促进作用，Cu2+的抑制作用最为明显，K+、Na+多糖产生几乎没有影响，Mg2+、Fe3+、Mn2+低浓度时促进胞外多糖的产生。
　　胞外粗多糖经过醇沉和sevege法除蛋白后，随后经过DEAE纤维素阴离子交换柱及分子筛凝胶SephadexG-75分离得到纯化多糖。
　　多角度激光光散射仪分析得知多糖主要成分平均分子量约为32.29kDa。
　　单糖组分分析表明，SD-07的胞外多糖由Fuc（岩藻糖）、Gal(半乳糖)、Glc（葡萄糖）和Man（甘露糖）组成，其中Fuc∶Gal∶Glc∶Man=1.33∶1.00∶8.67∶27.33。
　　红外光谱分析(Infrared Spectra Analysis，FTIR)结果证明多糖中含有甘露糖和葡萄糖，并且其构型为β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖。
　　本论文研究结果:筛选出稳定高产高活性菌株180，其抗生素组分及抑菌活性等性质与原始菌株SD-07无显著差异，提示180是未来抗生素生产的合适菌株。胞外多糖的产量与Ca2+的存在有关系，结构解析结果为接合转移和胞外多糖之间的关系提供了可靠数据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 研究背景及意义

1．2 多烯大环内酯类抗生素

1．2．1 作用机理

1．2．2 抗生素制备

1．3 微生物胞外多糖

1．3．1 微生物胞外多糖的应用

1．3．2 多糖的结构解析方法

1．3．3 胞外多糖产生的影响因素

1．3．4 SD-07胞外多糖与接合转移之间的关系

1．4 本论文主要内容及研究价值

第二章 纺锤链霉菌SD-07及其突变株所产抗生素特性比较

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 实验仪器

2．1．4 试剂

2．2 实验方法

2．2．1 三种抗生素的提取与回收率

2．2．2 三种抗生素的中压液相分析

2．2．3 三种抗生素的组分分析

2．2．4 三种抗生素的抑菌活性

2．2．5 三种制备方法制备抗生素

2．2．6 三种方法所制备抗生素对人体内两种致病真菌的抑制作用

2．2．7 三种方法所制备抗生素的细胞毒性比较

2．2．8 三种方法所制备抗生素的致突变性比较

2．2．9 菌种筛选与保存

2．3 结果与讨论

2．3．1 三种抗生素的提取与得率

2．3．2 三种抗生素的中压液相分析

2．3．3 三种抗生素的组分分析

2．3．4 三种抗生素的抑菌活性结果比较

2．3．5 三种方法所制备抗生素

2．3．6 三种方法所制备抗生素对人体内两种致病真菌的抑制作用

2．3．7 三种方法所制备抗生素的细胞毒性比较

2．3．8 三种方法所制备抗生素的致突变性比较

2．3．9 菌种的筛选与保存

2．4 本章总结

第三章 纺锤链霉菌SD-07所产胞外多糖的特性研究及结构解析

3．1 实验材料

3．1．1 菌种

3．1．2 培养基

3．1．3 实验仪器

3．1．4 试剂与凝胶

3．2 实验方法

3．2．1 苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量

3．2．2 筛选多糖发酵时间

3．2．3 不同阳离子对多糖产量的影响

3．2．4 筛选多糖发酵用培养基

3．2．5 上清与菌体中多糖含量对比

3．2．6 提取后表面多糖的除杂和分离纯化

3．2．7 纯化后多糖分子量的测定

3．2．8 纯化后胞外多糖的酸解及组分测定

3．2．9 纯化后多糖的红外光谱分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 胞外多糖(EPS)测定方法的建立

3．3．2 EPS产生的影响因素

3．3．3 EPS的制备

3．3．4 EPS结构解析(表征)

3．4 本章总结

全文总结

参考文献

致谢