大鼠脊髓背角TRPV4在背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用

摘要

神经病理性疼痛(NP，neuropathic pain)因其反复发作，较难治愈，已成为严重危害人类健康的世界性难题。各种动物模型的出现为神经病理性疼痛的研究提供了基础。背根神经节持续受压(CCD，chronic compression of the dorsal rootganglion)模型是一种公认的神经病理性疼痛模型，其模拟了临床椎间孔狭窄所致的根性疼痛痛觉过敏和自发性疼痛等症状。
　　瞬时感受器电位离子通道（TRP，transient receptor potential）家族为最大的离子通道家族之一，其家族成员TRPV1和TRPV4作为感觉传导器，可参与介导各种病理因素所诱发的疼痛敏感过程。目前已经发现，TRPV1可表达于脊髓背角片层Ⅰ和Ⅱ，脊髓背角TRPV1离子通道可能介导NP的病理过程。研究发现，坐骨神经慢性压迫损伤模型大鼠脊髓背角TRPV1表达量增加可持续2周以上，并与机械痛敏的变化时程相一致。新的研究也指出，预先鞘内注射TRPV1抑制剂后，树脂毒素致痛模型大鼠脊髓背角TRPV1表达下调的同时可延缓大鼠热痛阈的升高，提示脊髓背角TRPV1可能与树脂毒素致痛模型大鼠神经痛的形成相关。以上研究表明脊髓背角TRPV1在神经病理性疼痛的发病机制中发挥重要的作用。
　　脊髓背角是外周感觉传入的聚集地，外周的伤害性感觉信息在上传至大脑产生痛觉前必须经过脊髓背角的初步整合，而大脑下传至外周的调制信息亦必须经过脊髓背角的加工处理，脊髓背角在解剖学结构和位置上的重要性决定了其势必在痛觉的传导中发挥重要作用。目前的研究结果显示TPRV4在神经系统的分布多见于DRG、皮肤感觉神经终端及游离神经末梢。我们课题组的研究也显示大鼠DRG神经元内TRPV4可参与CCD机械痛敏的病理过程;TRPV4可能通过NO-cGMP-PKG通路发挥作用。我们的研究还显示抑制DRG神经元内TRPV4的表达仅可部分减轻CCD诱导的疼痛过敏，提示CCD所致神经病理性疼痛还存在其他机制。我们近期通过免疫荧光技术发现CCD大鼠术侧脊髓背角TRPV4阳性表达增多。TRPV1和TRPV4同属TRP家族，氨基酸序列同源性较高，二者的生物活性具有较高的统一性。综合以上研究我们初步推断脊髓背角TRPV4可能参与CCD诱导的神经病理性疼痛的病理过程。
　　目的：
　　探讨瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4(TRPV4,transientreceptor potential vanilloid4)在脊髓背角是否有表达，大鼠背根神经节(dorsal rootganglion，DRG)持续受压（chronic compression of dorsal root ganglion，CCD）后，脊髓背角TRPV4基因及蛋白变化，初步探讨脊髓背角TRPV4在CCD致神经病理性疼痛中的作用。
　　方法：
　　1.制备CCD模型
　　采用清洁级健康成年雄性Wistar大鼠，共60只，随机分为三组，分别为空白对照组20只、CCD手术组20只、CCD+钌红组20只。CCD手术为将直径0.63mm长度约4mm“U”型不锈钢棒植入大鼠腰椎第4及第5椎间孔，使之挤压背根神经节及周围组织，挤压成功时可见术侧后肢肌肉突然的不自主收缩。空白组除了不插入钢棒外，其他步骤与CCD组相同。CCD术后第7天，CCD+钌红组大鼠进行鞘内注射TRPV4抑制剂钌红。
　　2.机械刺激痛阈值检测
　　机械刺激疼痛阈值检测选在术前1天，术后第7天鞘内注射给药前及给药后2小时。方法如下:
　　将大鼠置于红色半透明玻璃箱内适应环境30min，使用BME-404型电子式机械测痛仪以针刺端透过玻璃箱底部网格层垂直刺激大鼠术侧后肢足底第三、四趾间皮肤，缩爪或舔足现象为阳性表现。此时刺激数值即代表大鼠机械刺激痛阈值，连续测量需间隔5min，以5次测量的平均值作为变量进行数据统计。
　　3.脊髓背角TRPV4基因及蛋白检测
　　术后第7天大鼠机械刺激痛阈值检测结束后将所有大鼠处死取材，使用RT-PCR及Western Blot技术检测各实验组大鼠脊髓背角TRPV4基因及蛋白变化。
　　结果：
　　1.TRPV4在大鼠脊髓背角中的表达
　　Western-Blot和RT-PCR结果显示:空白对照组大鼠脊髓背角存在TRPV4蛋白及基因表达，表明TRPV4在脊髓背角有表达。
　　2.CCD模型后大鼠术侧脊髓背角内TRPV4表达变化
　　Western-Blot结果显示:与空白对照组相比，术后第7天，CCD手术组大鼠术侧脊髓背角TRPV4蛋白表达显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05);RT-PCR结果显示，与空白对照组相比，术后第7天，CCD手术组大鼠术侧脊髓背角TRPV4基因表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05);
　　3.钌红对CCD大鼠术侧机械刺激痛阈值的影响
　　机械刺激痛阈值测量结果显示:与CCD手术组相比，鞘内注射TRPV4抑制剂钌红2小时后，CCD+钌红组大鼠手术侧机械刺激痛阈值明显升高，差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　4.钌红对CCD大鼠术侧脊髓背角内TRPV4表达的影响
　　Western-Blot结果显示:与CCD手术组相比，鞘内注射TRPV4抑制剂钌红2小时后，CCD+钌红组大鼠术侧脊髓背角TRPV4蛋白表达显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。RT-PCR结果显示，与CCD手术组相比，鞘内注射TRPV4抑制剂钌红2小时后，CCD+钌红组大鼠术侧脊髓背角TRPV4基因表达显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　TRPV4蛋白在脊髓中有表达;CCD造模后脊髓背角内TRPV4的表达明显增高，鞘内注射钌红后，TRPV4的表达受到抑制的同时大鼠机械痛阈值明显提高。本研究表明，TRPV4参与了CCD所诱导的神经病理性疼痛的中枢性敏化过程。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

创新性与局限性

结论

附图

参考文献

致谢

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