TRPV4-MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用机制研究

摘要

本研究采用神经纤维电生理技术、Real-time PCR、Western Blot、免疫组织化学及免疫荧光等方法研究TRPV4-MAPK途径在CCD模型所致痛敏和DRG神经元异常放电中的作用，同时研究了脊髓背角内TRPV4蛋白表达及分布的变化，以期为神经病理性疼痛的发生探讨新理论。
　　第一部分:TRPV4-p38 MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用
　　目的：
　　1.研究干预TRPV4及p38 MAPK通路是否会影响大鼠背根神经节持续受压所致神经病理性疼痛。
　　2.研究大鼠背根神经节中TRPV4与p38 MAPK是否存在相互影响关系。
　　方法：
　　1.大鼠背根神经节持续受压模型制作
　　采用体重约为180-220g的健康成年雄性Wistar大鼠（购自山东大学实验动物中心），以水合氯醛（0.3ml/100g体重）腹腔麻醉后，暴露右侧L4及L5椎间外孔，将直径0.63mm“L”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁与脊柱斜向上成30。角插入椎间孔内，另一端位于椎间孔外。术后用生理盐水冲洗切口，依次缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤，术中采用无菌操作，术后给予青霉素腹腔注射以预防感染。剔除术后出现自残现象或出现感觉完全缺失的大鼠。
　　2.鞘内注射
　　以异氟烷和氧气混合吸入麻醉大鼠。大鼠皮肤消毒后，以双侧髂棘连线与脊柱的交点定位L4/L5椎间隙，向下一椎间隙及L5/L6椎间隙进针，微量注射器针头沿食指尖端刺入椎间隙（针头方向略偏向前方），至有突破感，大鼠出现侧向快速甩尾，表明进入蛛网膜下腔，小心回抽，无血液回流，以1ul/s的速度缓慢推注，鞘注完毕后快速抽出微量注射器，按压注射部位约1min，防止脑脊液漏出。结束操作，停止吸入麻醉，大鼠1min内可恢复翻正反射。
　　3.神经行为学测定-机械刺激缩爪反应痛阈的测量
　　室温25℃，安静明亮，将大鼠置于长*宽*高分别为40cm*20cm*40cm的红色半透明玻璃笼内，底部及顶部无玻璃覆盖，底部铺以0.5cm*0.5cm的金属网格。大鼠适应环境20分钟后，以BME-404型电子式机械测痛仪进行测试。以针刺端垂直刺激大鼠足底第三、四趾间皮肤，大鼠出现缩爪或舔足现象视为阳性，记录刺激数值(G)，每次刺激间隔5min，连续测5次，取其平均值作为统计变量。
　　结果：
　　1.鞘内注射激动剂及抑制剂后CCD大鼠机械刺激缩爪反应阈值的变化
　　CCD术后第二天大鼠机械刺激缩爪反应阈值明显下降，持续至14天(P＜0.01)，之后恢复至正常水平。给予RR和SB203580后，与盐水组相比，机械刺激缩爪反应阈值增高。给予4α-PDD和anisomycin后，机械刺激缩爪反应阈值明显降低。药物注射后2小时，反应最明显，没有明显的剂量依赖性。
　　2.CCD大鼠鞘内注射激动剂和抑制剂后TRPV4和p38蛋白表达的变化
　　RR和4α-PDD的使用浓度分别为1 nmol/L，10 nmol/L和100 nmol/L;SB203580的使用浓度为10μmol/L，20μmol/L和40μmol/L;anisomycin的使用浓度为5μg/mL，25μg/mL和40μg/mL。鞘内注射1、2、4、8小时后检测TRPV4，p38和P-p38的表达变化。对照组CCD大鼠鞘内注射等体积生理盐水。TRPV4，p38和P-p38的表达可被RR明显抑制(2-4 h for TRPV4;1-8 h for p38，1-4 hfor P-p38)，RR对TRPV4和p38蛋白表达的影响具有剂量依赖性。鞘内注射4α-PDD后，TRPV4蛋白表达增高(2 h)，同时p38和P-p38的表达也上调，10且具有剂量依赖性。鞘内注射SB203580可显著抑制p38和P-p38(4 h for p38;2-4 h for P-p38)的蛋白表达，但TRPV4(1-8 h)的表达明显上升且不具有剂量依赖性。鞘内注射anisomycin后;p38蛋白表达显著增高（1-2 h），TRPV4的表达显著降低(1-8 h)，P p38的表达无明显变化，无明显的剂量依赖性。
　　结论：
　　1.干预TRPV4及p38 MAPK通路可影响大鼠背根神经节持续受压所致神经病理性疼痛的程度，TRPV4及p38 MAPK参与了CCD后神经病理性疼痛的形成。
　　2.大鼠背根神经节TRPV4与p38 MAPK存在相互影响关系。
　　第二部分:MAPK通路参与介导大鼠背根神经节持续受压后的神经病理性疼痛
　　目的：
　　研究MAPK通路是否参与大鼠背根神经节持续受压后神经病理性疼痛的形成与发展
　　方法：
　　1.实验动物及造模
　　健康成年雄性Wistar大鼠，购自山东大学实验动物中心，体重180220g，室内层流滤菌，室内温度20+-2。C，每笼两只，维持12小时昼夜节律，水、食持续供给。大鼠笼内饲养适应环境7天后开始进行后续实验。所有动物实验已经经过山东大学实验动物伦理委员会批准。
　　采用10％水合氯醛(300mg/100g i.p.)腹腔注射，将不锈钢棒插入右侧L4、L5椎间外孔，假手术组手术方式同手术组，仅不插入钢棒。剔除出现自噬、感觉缺陷及残疾的大鼠。
　　2.行为学测试
　　于术前、术后4天及给药后2小时进行机械刺激缩爪反应阈值测定。采用BEM-404型机械刺激仪（中国医学科学院研制）检测机械刺激缩爪反应阈值的变化。将刺激针对准大鼠足底第三、四足趾间皮肤，缓慢均匀施加刺激力，出现缩爪或舐足为阳性反应，记录此刻施加的力，间隔5min再次测试，重复5次，取平均值。
　　结果：
　　1.CCD术后机械刺激缩爪反应阈值的变化
　　CCD术后4天大鼠术侧机械刺激缩爪反应阈值明显降低(n=8 in each group，**P＜0.01)。CCD诱导的机械痛敏可被SB203580，SP00125或U0126(n=8 in eachgroup，＃P＜0.05)缓解，假手术组与对照组相比，无明显差异。
　　2.背根神经节内p38、erk及jnk蛋白表达的变化
　　CCD术后，大鼠背根神经节内p38、erk及jnk蛋白表达及磷酸化水平显著增高（n=5，*p＜0.05，**p＜0.01与对照组相比;#p＜0.05，##p＜0.01与假手术组相比）。CCD诱导的MAPKs蛋白表达及磷酸化水平增高可被相应的抑制剂抑制(SB203580 for p38，SP600125 for JNK，UO126 for ERK)(&p＜0.05,&&p＜0.01与CCD组相比).
　　3.背根神经节内p38、erk及jnk基因表达的变化
　　MAPK通路抑制剂不仅可以抑制CCD术后大鼠背根神经节神经元细胞内p38，ERK和JNK蛋白表达，也可影响其基因表达。CCD术后大鼠背根神经节内p38，JNK和ERK基因表达上调（n=6，*p＜0.05，*pp＜0.01与对照组相比）。CCD诱导的MAPK基因水平上调可被其特异性抑制剂抑制（n=6，##p＜0.01与CCD组相比）。
　　结论：
　　1.MAPK通路参与大鼠背根神经节持续受压后神经病理性疼痛机制
　　2.抑制MAPK通路可缓解CCD诱导的神经病理性疼痛
　　第三部分:大鼠背根神经节持续受压后脊髓背角TRPV4蛋白表达及分布的变化
　　目的：
　　探讨大鼠背根神经节持续受压(CCD)后瞬时感受器电位离子通道香草素亚族受体4(TRPV4)在脊髓背角中的蛋白表达及分布规律。
　　方法：
　　1.实验分组
　　选取清洁级雄性Wistar大鼠30只，按随机数字表法分组:空白对照组5只，手术组25只（术后4天、7天、14天、28天各5只;免疫荧光组5只）。
　　2.制备大鼠背根神经节持续受压模型
　　手术方式同第一部分。
　　3.行为学检测
　　于造模成功后4天，7天，14天及28天，测量机械刺激缩爪反应痛阈，观察机械痛阈的变化。
　　结果：
　　1.大鼠背根神经节持续受压后机械痛阈变化
　　手术组分别于术前及背根神经节持续受压后4天、7天、14天、28天测量大鼠机械刺激缩爪反应痛阈，对照组同时进行测量。与术前相比，术后4天，7天及14天时机械痛阈值明显下降，差异有显著性意义(n=5，P＜0.001);对照组不同时间测量结果无明显差异。
　　2.脊髓背角TRPV4蛋白表达变化
　　于术后4，7，14与28天进行完行为学测试后取材。与空白对照组比较，大鼠背根神经节持续受压后4天及7天，手术侧脊髓背角TRPV4表达升高，差异有显著性意义(n=5，p＜0.01);14天及28天，差异无统计学意义。手术对侧与对照组相比，差异无统计学意义。
　　结论：
　　大鼠背根神经节持续受压后，机械痛阈下降的同时，手术侧脊髓背角内TRPV4蛋白表达上调及阳性数目增多，TRPV4可能参与CCD后神经病理性疼痛的中枢敏化机制。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 TRPV4-p38 MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 MAPK通路参与大鼠背根神经节持续受压后神经病理性疼痛机制

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第三部分 大鼠背根神经节持续受压后脊髓背角TRPV4蛋白表达及分布的变化

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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