刺参多糖对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制研究

摘要

帕金森症(Parkinson's disease，PD)是第二大神经退行性疾病，主要病理特点是多巴胺能神经元选择性缺失和路易小体的存在，多巴胺能神经元缺失会导致多巴胺产生和释放减少，从而引起一系列运动和非运动症状，严重威胁着老年人的身体健康和生活质量。PD的发病机制极其复杂，环境和遗传因素都可能导致疾病的发生，氧化应激被认为是PD中神经元退变的重要因素，因此具有抗氧化活性的药物可能会对PD的治疗起到一定积极作用。
　　刺参多糖是刺参体壁中一种重要的活性成分，具有抗肿瘤、抗凝血和免疫调节等多种生物活性。我们实验室前期从鲜刺参体壁中分离纯化得到一种多糖，命名为SJP，前期研究已经证实SJP具有抗缺氧/复氧损伤的作用，并且作用机制可能与抗氧化有关。6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤模型是目前经常用到且比较成熟的体外PD模型。因此，本课题的目的是研究SJP对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用，并对其作用机制进行探讨，从而在体外评估SJP用于PD治疗的可能性。主要研究内容如下:
　　1、研究SJP对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
　　采用MTT法检测SJP和6-OHDA对细胞存活率的影响，结果显示6-OHDA可显著降低细胞存活率，而SJP能够提高细胞存活率。采用Hoechst33342/PI染色检测细胞的死亡情况，结果显示6-OHDA会促进细胞凋亡与坏死，而SJP可以抑制细胞凋亡与坏死。使用LDH试剂盒检测上清液中LDH水平，结果显示，6-OHDA会升高上清液中LDH释放量，而SJP会抑制LDH的释放。使用ROS和SOD试剂盒分别检测细胞ROS产生水平和SOD活力，结果显示，6-OHDA会升高细胞ROS水平，降低SOD活力，而SJP会降低ROS水平，升高SOD活力。上述结果表明SJP可以抑制6-OHDA诱导的氧化应激和细胞死亡。
　　2、研究SJP保护6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用机制
　　使用JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化情况，结果显示，6-OHDA会降低细胞线粒体膜电位，而SJP会升高线粒体膜电位。采用Western Blot实验检测细胞中Bax、Bcl-2、胞浆cytochrome c、线粒体cytochrome c、procaspase-3、cleaved caspase-3、procaspase-9以及cleaved caspase-9的蛋白表达水平，结果显示6-OHDA会升高Bax/Bcl-2、胞浆cytochrome c/线粒体cytochrome c、cleavedcaspase-3/procaspase-3和cleaved caspase-9/procaspase-9的比值，而SJP会降低上述四种比值，表明SJP会抑制线粒体凋亡途径。采用Western Blot实验检测p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt的蛋白水平，结果显示6-OHDA会升高p-p38/p38、p-JNK/JNK和p-ERK/ERK的比值，降低p-Akt/Akt的比值，而SJP预处理会降低p-p38/p38、p-JNK/JNK的比值，升高p-Akt/Akt的比值，对p-ERK/ERK的比值无影响，表明SJP会抑制p38 MAPK和JNK通路的激活，并抑制PI3K/Akt通路的失活。使用p38、JNK、ERK和Akt抑制剂以及Western Blot实验检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况，结果显示，p38和JNK抑制剂会进一步降低Bax/Bcl-2、胞浆cytochrome c/线粒体cytochrome c、cleavedcaspase-3/procaspase-3、cleaved caspase-9/procaspase-9的比值，表明抑制p38和JNK通路会进一步促进SJP的线粒体凋亡抑制作用，而与300μg/mL SJP组相比，Akt抑制剂处理会升高Bax/Bcl-2、胞浆cytochrome c/线粒体cytochrome c、cleavedcaspase-3/procaspase-3、cleaved caspase-9/procaspase-9的比值，表明抑制PI3K/Akt通路会减弱SJP的线粒体凋亡抑制作用。上述结果表明，SJP可以抑制p38 MAPK和JNK通路的激活以及PI3K/Akt通路的失活，进而抑制线粒体凋亡途径，最终发挥神经保护作用。
　　综上所述，SJP可以通过抑制p38 MAPK和JNK通路的激活以及PI3K/Akt通路的失活，进而抑制细胞线粒体凋亡途径，最终对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤起保护作用。
　　本课题从细胞水平研究了SJP对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，并深入探讨了SJP的作用机制，为PD的治疗提供了新的方法和依据，也为刺参以及海洋糖类药物的进一步开发利用提供了实验依据。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

第一章 绪论

1．1 帕金森症研究概述

1．1．1 帕金森症简介

1．1．2 氧化应激与帕金森症

1．1．3 线粒体细胞凋亡途径与帕金森症

1．1．4 MAPK信号通路与帕金森症

1．1．5 PI3K／Akt信号通路与帕金森症

1．2 刺参多糖研究现状

1．2．1 刺参多糖简介

1．2．2 剌参多糖药理活性

1．3 课题研究内容及意义

第二章 刺参多糖对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

2．1 实验材料及仪器设备

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 溶液配方

2．2 实验方法

2．2．1 细胞的复苏与冻存

2．2．2 细胞的传代与培养

2．2．3 MTT法检测刺参多糖对正常细胞存活率的影响

2．2．4 MTT法检测6-OHDA对正常细胞存活率的影响

2．2．5 MTT法检测刺参多糖对6-OHDA处理的细胞存活率的影响

2．2．6 细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测细胞死亡情况

2．2．7 乳酸脱氢酶测试盒检测细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶活性

2．2．8 活性氧检测试剂盒检测细胞ROS水平

2．2．9 总超氧化物歧化酶测试盒检测细胞内SOD活力

2．2．10 数据统计

2．3 实验结果

2．3．1 刺参多糖对正常细胞存活率的影响

2．3．2 6-OHDA对正常细胞存活率的影响

2．3．3 刺参多糖对6-OHDA处理的细胞存活率的影响

2．3．4 刺参多糖抑制6-OHDA诱导的细胞凋亡与坏死

2．3．5 刺参多糖抑制6-OHDA诱导的胞浆LDH的释放

2．3．6 刺参多糖抑制6-OHDA诱导的细胞ROS的产生

2．3．7 刺参多糖保护细胞SOD活力

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 刺参多糖作用机制的研究

3．1 实验材料与仪器设备

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要仪器设备

3．1．3 溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 用JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位

3．2．2 Western Blot检测剌参多糖对细胞内线粒体凋亡途径、MAPK通路和PI3K／Akt通路相关蛋白表达水平的影响

3．2．3 Western Blot检测MAPK和PI3K／Akt通路抑制剂对细胞线粒体凋亡途径相关蛋白表达水平的影响

3．2．4 数据统计

3．3 实验结果

3．3．1 刺参多糖抑制6-OHDA诱导的线粒体膜电位的下降

3．3．2 刺参多糖抑制细胞线粒体凋亡途径

3．3．3 刺参多糖抑制MAPK通路的激活

3．3．4 刺参多糖抑制PI3K／Akt通路的失活

3．3．5 MAPK抑制剂抑制线粒体细胞凋亡途径

3．3．6 PI3K／Akt抑制剂促进细胞线粒体凋亡

3．4 讨论

3．5 小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文