转糖基α-半乳糖苷酶筛选及Globotriose酶法合成研究

摘要

本论文首先进行了具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的筛选，目标是以乳糖为糖基受体筛选获得能够合成Galα1-4糖苷键的糖苷酶。通过TAIL-PCR技术和常规PCR技术克隆了不同微生物来源的9个α-半乳糖苷酶基因，即干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) JCM1134α-半乳糖苷酶基因agaLc(2295 bp)，短乳杆菌(Lactobacillus breve) JCM1059α-半乳糖苷酶基因agaLb737(2214 bp)，产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）ATCC13124α-半乳糖苷酶CPF_0491基因(2205 bp)，以及脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)NCTC9343来源的α-半乳糖苷酶BF1418、BF4189、BF0233、BF0498、BF0803、BF0227基因(大小分别为1503bp、1491bp、2160 bp、2169bp、2076 bp、1593 bp)。
　　将这些α-半乳糖苷酶基因与pBAD/His A载体连接转化表达宿主E.coliLMG194,构建基因工程菌用于重组酶的诱导表达。9个重组α-半乳糖苷酶均可以表达出可溶性蛋白，重组酶粗酶液均表现出对对硝基半乳糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPαGal)的水解活性。用重组酶粗酶液催化以pNPαGal为供体、乳糖为受体的转糖基反应研究结果说明，除BF0803外，其余8个重组酶均可以催化合成以乳糖为受体的转糖基产物。其中CPF_0491、BF0233和BF0227合成的转糖基产物经TLC检测与globotriose标准品迁移率一致，转糖基产物进一步经高效阴离子交换色谱(HPAEC)检测，发现只有BF0227的转糖基产物与globotriose标准品保留时间一致。对转糖基产物进行乙酰化修饰，NMR分析结构表明该产物为半乳糖以α1-4糖苷键与乳糖连接的寡糖，这是首例可以以天然乳糖为受体催化合成Galα1-4糖苷键的α-半乳糖苷酶，因此后续的研究工作均围绕BF0227开展。
　　进一步研究表明，由于重组酶BF0227在已经构建的大肠杆菌表达系统中无法实现Ni-亲和层析纯化。该酶基因大小为1593 bp，编码约58.3KDa的蛋白，属于GH27家族，根据SignalP4.1分析，其N-端的24个氨基酸为预测的理论信号肽序列。进而克隆BF0227基因去除的N-端信号肽编码的核苷酸序列，命名为agaBf3S，构建基因工程菌E.coli LMG194/pBAD/His A-agaBf3S，对重组酶AgaBf3S进行诱导表达，经过Ni-亲和层析纯化得到AgaBf3S纯酶，分子量约59.2kDa。对其进行酶学性质研究，在进行水解反应时，AgaBf3S最适pH4.5,在pH4.0-11.0范围内稳定，最适温度40℃，温度高于40℃时迅速失活。重组酶AgaBf3S受各种离子的影响较小，为非离子依赖的酸性中温糖苷酶。AgaBf3S可高效水解pNPαGal，当以oNPαGal底物时，其水解活力为pNPαGal水解活力的37.58％，对其它底物如mNPαGal、β-糖苷键连接底物或非半乳糖硝基苯糖苷均没有水解活性。对AgaBf3S水解人工及天然底物的Km和kcat分别进行的测定结果表明，AgaBf3S水解pNPαGal、蜜二糖和globotriose的Km和kcat值分别为1.27mM和172.97 S-1,62.76 mM和7.74 S-1,4.62 mM和388.45 S-1;AgaBf3S水解pNPαGal、蜜二糖和globotriose的kcal/Km值分别为135.88 mM-1S-1,0.28 mM-1S-1,84.12 mM-1S-1。以上三种底物中，AgaBf3S对pNPαGal的亲和力和水解效率均最高，说明pNPαGal较合适作为转糖基反应供体。
　　将AgaBf3S以pNPαGal为供体、以乳糖为受体进行转糖基反应，并对反应条件进行优化，研究了底物浓度、pH、温度等对产物产率的影响，确定产物产率最高的反应条件为:起始乳糖浓度500 mM、pNPαGal浓度20 mM、酶浓度0.6 U/mL，在100 mM pH4.5 NaAc缓冲液中40℃反应30 min，此时产物(命名为PLac)产率为32.4％。对产物进行分离纯化，并将其1HNMR谱及1H，13C-HSQC谱与globotriose的标准品的相关谱图进行比较，结合TLC迁移率、质谱结果、HPAEC保留时间分析，确定该转糖基产物为globotriose。该结果显示AgaBf3S是一步法合成globotriose的新型工具酶。进一步研究了该酶的转糖基受体选择性，以多种二糖、单糖和糖醇为受体建立转糖基反应，结果表明AgaBf3S可以在纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖等二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖等醛糖为受体时合成转糖基产物，并且受体非还原端为半乳糖时产物产量较高，在以山梨糖、果糖等酮糖，甘露醇、山梨醇等糖醇以及木糖和鼠李糖为受体时无转糖基产物生成，说明糖基受体糖环结构、羟基位置，尤其是C-4上羟基的键型对于AgaBf3S的受体选择性具有十分重要的影响。
　　进一步通过随机突变与定点突变相结合的方式获得了转糖基效率提高的突变酶，同时对AgaBf3S受体选择性相关的氨基酸位点进行了研究。α-半乳糖苷酶催化合成反应时遵循糖苷酶的一般作用机制，在反应后期还会对转糖基产物进行二次水解，因此产物产量不高。为了提高AgaBf3S催化合成globotriose的产率，对AgaBf3S进行了随机突变研究，确定了2个对转糖基产物产率有较大影响的氨基酸位点，并对这两个氨基酸位点进行了不同类型的氨基酸替换，最终得到了突变酶A141W和H426S，其转糖基产物产率分别为36.06％和38.25％，与原始酶（产率为32.4％）相比，产率分别提高了11％和18％。通过对AgaBf3S进行同源模建(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index，模板为链霉菌(Streptomyces avermitilis MA-4680)来源的β-L-阿拉伯糖苷酶Arap27A)，根据其三维模拟结构发现，A141位于催化腔的腔口，可能是由于该位点的丙氨酸突变成了非极性的色氨酸后导致反应腔内水活度降低，转糖基产物可以大量积累。通过结构比对，推测出多个与AgaBf3S催化活性相关的重要氨基酸位点，其中D135为亲核位点，D191为酸碱催化位点，D48、K133、C170、R187为底物结合位点，Y101、W172、P194为推测的配体结合位点。通过氨基酸定点突变进一步确定了W172为受体结合相关位点，该位点的色氨酸突变为苯丙氨酸后，可以以pNPαGal为受体合成大量自转产物，而原始酶不以pNPαGal为受体合成自转产物，说明该位点氨基酸的替换改变了酶的受体选择性。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 绪论

1．1 糖生物学概述

1．2 糖链与疾病

1．2．1 糖脂与肿瘤

1．2．2 Globotriose与微生物感染

1．3 寡糖的合成

1．3．1 寡糖的化学合成

1．3．2 糖基转移酶及其在寡糖合成中的应用

1．3．3 糖苷酶及其在寡糖合成中的应用

1．4 α-半乳糖苷酶

1．4．1 α-半乳糖苷酶的反应机制

1．4．2 α-半乳糖昔酶的水解作用

1．4．3 α-半乳糖苷酶的转糖基作用

1．5 重组DNA技术

1．5．1 已知序列目的基因的克隆

1．5．2 TAIL-PCR

1．6 糖苷酶的分子改造

1．6．1 定点突变

1．6．2 随机突变

1．6．3 C-端缺失和DNA shuffling

1．7 糖分析与鉴定

1．7．1 离子色谱

1．7．2 质谱

1．7．3 核磁共振

1．8 本论文的研究内容及意义

第二章 转糖基α-半乳糖苷酶的筛选

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂和仪器

2．1．2 菌株及质粒

2．1．3 培养基及培养条件

2．1．4 L．casei JCM1134来源的α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

2．1．5 L．breve JCM1059来源的α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

2．1．6 C．perfringens ATCC 13124来源的α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

2．1．7 B．fragilis NCTC9343来源的α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

2．1．8 重组酶的活性分析及转糖基产物的初步鉴定

2．2 结果

2．2．1 L．casei JCM1134来源的α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

2．2．2 L．breve JCM1059来源的α-半乳糖苷酶的克隆与表达

2．2．3 C．perfringens ATCC 13124来源的α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

2．2．4 B．fragilis NCTC9343来源的α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达

2．2．5 重组酶的活性分析及转糖基产物的初步鉴定

2．3 讨论

2．4 本章小结

第三章 α-半乳糖苷酶AgaBf3S的酶学性质及Globotriose的酶法合成研究

3．1 材料与方法

3．1．1 主要试剂和仪器

3．1．2 菌株和质粒

3．1．3 培养基和培养条件

3．1．4 α-半乳糖苷酶AgaBf3S基因的克隆与表达

3．1．5 α-半乳糖苷酶AgaBf3S的酶学性质

3．1．6 Globotriose的酶法合成

3．1．7 α-半乳糖苷酶AgaBf3S受体选择性分析

3．2 结果

3．2．1 α-半乳糖苷酶AgaBf3S基因的克隆与表达

3．2．2 α-半乳糖苷酶AgaBf3S的酶学性质

3．2．3 Globotriose的酶法合成

3．2．4 α-半乳糖苷酶AgaBf3S的受体选择性分析

3．3 讨论

3．4 本章小结

第四章 α-半乳糖苷酶AgaBf3S的分子改造

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂和仪器

4．1．2 菌株与质粒

4．1．3 培养基及培养条件

4．1．4 基因操作技术

4．1．5 重组蛋白的诱导表达

4．1．6 高效突变酶的筛选

4．1．7 AgaBf3S的同源模建

4．1．8 其它氨基酸位点的定点突变

4．2 结果

4．2．1 AgaBf3S的随机突变及高效突变酶的筛选

4．2．2 AgaBf3S的定点突变及高效突变酶的筛选

4．2．3 AgaBf3S的氨基酸位点分析

4．2．4 其它氨基酸位点的定点突变

4．3 讨论

4．4 本章小结

全文总结

参考文献

攻读博士学位期间取得的的学术成果

致谢