靶向FtsZ的新型肉桂酰胺类抗菌剂的设计、合成及生物活性研究

摘要

目前，细菌性感染仍然是一个重要的全球性公共健康问题，它严重地威胁着人类的健康甚至生命安全。出现这种问题的主要原因，一方面是抗生素的广泛使用以及滥用所造成的耐药菌的流行;另一方面是近年来新型抗菌药物的研发速度远远落后于细菌耐药的进化速度，细菌的耐药性已经使得许多临床上有效的抗菌药物纷纷降低疗效或者彻底失效。面对近年来出现的越来越多的耐药菌，我们几乎面临着无药可选的境地，因此，我们迫切需要开发新型的抗菌药物以适应当前不断增长的医疗需求。
　　由于通过对现有的抗菌药物进行结构修饰以获得有效的抗菌药物变得越来越困难，开发靶向于新颖细菌重要蛋白的抗菌药物引起了越来越多的科研工作者的极大兴趣。我们通过对近年来出现的十多种抗菌药物新靶点进行研究和分析，发现细菌细胞分裂蛋白FtsZ具有作为抗菌药物靶点的多种优良潜质，并且它已被确证可作为一个有希望的抗菌药物新靶点。
　　本论文选取了新型细菌细胞分裂蛋白FtsZ作为开发抗菌药物的新靶点。通过分子模拟和文献研究，我们发现近10种不同菌株来源的FtsZ蛋白具有高度的相似度，遂选取了金黄色葡萄球菌FtsZ蛋白作为代表，系统地研究了它的主要活性口袋及其特点。另外，我们还研究了目前报道的50多个具有FtsZ抑制活性的天然产物以及200多个具有不同结构类型的FtsZ合成抑制剂。通过此研究，我们发现肉桂醛不仅具有理想的性质，而且具有明确的作用部位。更重要的是，我们发现肉桂醛的结合区域与已知FtsZ抑制剂PC190723的结合区域相邻，并且目前没有同时对这两个结合区域进行药物开发的相关研究，因此我们设计了能同时作用于这两个结合区域的FtsZ抑制剂，以保留肉桂醛较宽抗菌谱的同时，改善其较弱的抗菌活性。此外，据报道肉桂醛的衍生物-肉桂酸也具有初步地靶向FtsZ的抗菌活性，这为我们的化合物设计提供了重要参考。
　　我们以苯甲醛衍生物为起始原料，经Knoevenagel缩合反应、酰氯化反应和酰胺化反应等，合成了四个系列，共计102个目标化合物，建立了所有关键中间体的合成路线，并通过多种图谱等对目标化合物的结构进行了表征。在活性评价方面，我们通过微量肉汤稀释法测定了所有目标化合物及对照药物肉桂酸(CA)、姜黄素(Cur)、盐酸环丙沙星(Cipro)及苯唑西林钠(OS)对于七种革兰氏阳性菌株和两种革兰氏阴性菌株的抗菌活性，并测定了这些化合物对于两种代表性的革兰氏阳性菌株和两种代表性的革兰氏阴性菌株的抑制细胞分裂的初步靶向活性，此外，我们还对具有初步靶向活性的代表性化合物进行了标准的GTP酶活性实验和光散射实验，在分子水平上对于这些化合物的靶向性进行了进一步的确证。
　　该类化合物的生物活性总结如下:化合物C12表现出较好的生物活性。在抗菌活性方面，它对于表皮葡萄球菌的MIC值为4μg/mL，该活性分别是CA、Cur和Cipro活性的32倍或32倍以上;对于敏感型金黄色葡萄球菌的MIC值为4μg/mL，该活性是CA和Cur活性的32倍或32倍以上;此外，该化合物对于耐青霉素的金黄色葡萄球菌也表现出了较好的活性，其MIC值为16μg/mL，该活性分别是CA、Cur、Cipro和OS活性的8倍以上。在细胞分裂的抑制活性方面，该化合物对于敏感型金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为1μg/mL，该活性是靶向对照药物CA和Cur活性的128倍或128倍以上。化合物D3表现出较好的生物活性。在抗菌活性方面，它对于耐青霉素的金黄色葡萄球菌的MIC值为2μg/mL，该活性分别是CA、Cur、Cipro和OS活性的64倍以上;对于敏感型金黄色葡萄球菌的MIC值为2μg/mL，该活性分别是CA、Cur、Cipro和OS活性的4-64倍以上;对于枯草芽孢杆菌的MIC值为4μg/mL，该活性分别是CA和Cur活性的8-32倍以上。在细胞分裂的抑制活性方面，该化合物对于枯草芽孢杆菌的最小抑制浓度为4μg/mL，该活性分别是具有靶向性的对照药物CA和Cur活性的4-32倍以上;对于敏感型金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为16μg/mL，该活性是CA和Cur活性的8倍或8倍以上。化合物D15表现出较好的生物活性。在抗菌活性方面，它对于耐青霉素的金黄色葡萄球菌的MIC值为4μg/mL，该活性分别是CA、Cur、Cipro和OS活性的32倍以上。在细菌细胞分裂抑制活性方面，该化合物对于枯草芽孢杆菌的最小抑制浓度为1μg/mL，该活性分别是靶向对照药物CA和Cur活性的16-128倍以上;对于敏感型金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为2μg/mL，该活性是CA和Cur活性的64倍或64倍以上。在GTP酶活性实验和光散射实验中，所测试的代表性化合物均明显地抑制了FtsZ的活性，并且该活性与其抗菌活性及抑制细菌细胞分裂的活性基本一致，这表明该类化合物可能通过靶向FtsZ发挥抗菌作用。通过该研究，我们得到了一些优秀的先导化合物（A46、A66、A610、C1、C7、C8、C12、D3、D4和D15）。这些先导化合物对肉桂酰胺类以及其他结构类型的FtsZ抑制剂的设计和发现具有重要的价值。
　　通过生物活性测定研究，我们对该类化合物的构效关系总结如下:在A系列化合物中，对于大多数测试菌株，母核苯环和酰胺N任一位置上的取代基发生改变，化合物的活性均会发生明显变化。我们推测母核苯环上的取代基可能会协助化合物在T7-loop区活性疏水口袋中锚定结合位置，酰胺N上的取代基需满足受体中结合位置的空间性质要求，化合物才能发挥较好的作用。B系列目标化合物的母核苯环由不同体积、电性、脂溶性等性质的取代基取代，酰胺N由(1H-苯并咪唑-2-基）甲基片段取代。该系列化合物整体上表现出较弱的活性，这可能是因为酰胺N上的苯并咪唑片段在空间取向上不能与受体发生很好的契合，影响了化合物与受体的结合，从而导致了该系列大多数化合物较弱的活性。C系列化合物的母核酰胺N同时为2-甲基-1H-苯并咪唑的1位环内N。该系列化合物整体上表现出比A系列和B系列化合物明显增强的活性，这表明母核中苯并咪唑的空间取向可能对于化合物与受体的结合以及化合物的生物活性产生了重要影响。然而，当母核苯环上引入多个甲氧基时，化合物活性明显降低，这可能是由于多个甲氧基的引入增大了化合物的位阻，影响了其与受体的有效结合。D系列化合物的母核中酰胺N同时为C-2位带有不同取代基的1H-苯并咪唑的1位环内N。该系列化合物表现出了较大差异的生物活性，母核中苯并咪唑片段C-2位只能容纳合适性质的较小取代基，表明该位置在受体中的结合位置可能具有较小的空间，此外，其C-6位取代能够产生较好活性的化合物，该位置的取代基有可能能够向上延伸至PC位点或者胍甲基二芳基化合物的结合位点。
　　综上所述，我们首次成功设计并发现了一类靶向FtsZ的新型肉桂酰胺类抗菌化合物。它们在细胞水平和分子水平上都表现出了较好的生物活性，在虚拟对接研究中，这些化合物能结合到肉桂醛的结合口袋，并拓展性地结合到了PC190723甚至胍甲基二芳基化合物的结合口袋，理论上达到了多靶点药物设计的目的，而基因水平的结合位点确证工作正在进行中。该研究不仅得到了一些结构新颖且活性较好的先导化合物，而且进一步加深了我们对于FtsZ蛋白空间结构的认识。这不仅对发现更优良的肉桂酰胺类以及其它结构类型的FtsZ抑制剂具有重要的价值，而且为今后更进一步地研究FtsZ蛋白的结构和功能奠定了坚实的基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1 抗菌药物的发展

1．1．1 抗生素及半合成抗生素

1．1．2 合成抗菌药物

1．2 细菌的耐药性

1．2．1 抗菌药物作用靶点结构的改变

1．2．2 细菌对药物的外排

1．2．3 细菌外膜通透性的降低

1．2．4 细菌水解酶或者钝化酶的产生

1．2．5 细菌代谢关键酶数量的改变

1．2．6 细菌形成生物膜

1．3 抗菌药物的新靶点FtsZ

1．3．1 FtsZ的结构

1．3．2 FtsZ的功能

1．3．3 FtsZ抑制剂的筛选方法

1．4 FtsZ抑制剂

1．4．1 天然产物与半合成化合物

1．4．2 合成化合物

第二章 目标化合物的设计

2．1 设计背景

2．2 FtsZ蛋白已知活性口袋的分析

2．3 FtsZ蛋白活性口袋的选择

2．4 目标化合物的设计

2．4．1 A系列目标化合物的设计

2．4．2 B系列目标化合物的设计

2．4．3 C系列目标化合物的设计

2．4．4 D系列目标化合物的设计

第三章 目标化合物的合成

3．1 关键中间体的合成

3．1．1 肉桂酸类化合物的合成

3．1．2 苯并咪唑类化合物的合成

3．2 A系列目标化合物的合成

3．2．1 合成路线

3．2．2 实验操作

3．3 B系列目标化合物的合成

3．3．1 合成路线

3．3．2 实验操作

3．4 C系列目标化合物的合成

3．4．1 合成路线

3．4．2 实验操作

3．5 D系列目标化合物的合成

3．5．1 合成路线

3．5．2 实验操作

第四章 目标化合物的生物活性研究

4．1 实验材料

4．1．1 试剂及药品

4．1．2 仪器设备

4．1．3 受试菌株

4．2 最小抑菌浓度的测定

4．2．1 实验原理

4．2．2 实验方法

4．2．3 结果与讨论

4．3 最小抑制细胞分裂浓度的测定

4．3．1 实验原理

4．3．2 实验方法

4．3．3 结果与讨论

4．4 GTP酶抑制活性的测定

4．4．1 实验原理

4．4．2 实验方法

4．4．3 结果与讨论

4．5 FtsZ聚合抑制活性的测定

4．5．1 实验原理

4．5．2 实验方法

4．5．3 结果与讨论

4．6 结论

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

致谢

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附录