STAT3乙酰化依赖性的线粒体定位及丙酮酸代谢调控

摘要

研究背景：
　　信号转导和转录活化因子(Signal Transducers and Activators ofTranscription，STAT)家族蛋白表达于多类机体组织和细胞内，参与调控细胞生长、分化、凋亡、DNA损伤修复等多种生理途径。STAT3是STAT家族的重要成员，最早被发现为癌基因[1]。STAT3可接受外界各类生长因子和细胞因子等刺激信号，调控下游目的基因表达，进而调节细胞的各项生理过程。近期研究发现STAT3也是一种多功能转录调节因子，其在乳腺癌、白血病及头颈部鳞癌等多种肿瘤组织及细胞系中表现持续性活化[2]，说明STAT3信号转导通路的激活密切关联于多类肿瘤的发生发展[3-5]。STAT3调节下游靶基因的转录，可通过与其他调节因子形成复合物的方式，也可以通过酪氨酸位点（如Y705）的磷酸化[6]，分子间酪氨酸磷酸化位点与SH2结构域的相互作用，在细胞浆部位形成同源或者异源二聚体，移位至胞核内进而调控下游靶基因的表达水平[7]。被激活的STAT3可调节下游基因的表达活性及细胞生理功能[8]，例如凋亡抑制基因（Bcl-xl、Survivin、Mc-Ⅰ等），细胞周期凋亡基因（Cyclin D1/D2、cMyc等），肿瘤转移相关基因（金属蛋白酶MMPs等）和血管内皮生成因子（VEGF等）。
　　经细胞因子处理后，细胞浆内的信号转导与转录激活因子(STAT)家族蛋白羧基末端（C末端）结构域的氨基酸残基发生一系列翻译后修饰变化[9]，例如705位酪氨酸残基和727位丝氨酸残基发生磷酸化，685位赖氨酸残基发生乙酰化[7，10，11]。组蛋白乙酰基转移酶CBP可介导STAT3的Lys685位点的乙酰化，该乙酰化过程是可逆的，可在Ⅰ型组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和（或）Sirtuins家族特定成员的催化下发生去乙酰化反应。C末端结构域Tyr705/ Ser727磷酸化的STAT3在细胞核与目的基因启动子结合在转录激活进程中起着至关重要的作用[12，13]。STAT3磷酸化激活的基因参与不同的生理进程，包括干细胞的自我更新、T细胞的分化、细胞周期和增殖等[14-17]。Lys685位点的乙酰化对于STAT3形成稳定的二聚体、细胞生长相关基因的转录增强以及促进反映抑瘤素M治疗的细胞循环进程具有决定性的功能，而这种二聚体对细胞因子刺激的DNA结合和转录调控也是必需的[7]。
　　STAT3 Ser727位点磷酸化的发生促使细胞浆内的STAT3向线粒体转移[18]。采用STAT3表达缺陷型PC3细胞进行检测，表达S727A突变型STAT3的PC3细胞的生理状态与表达野生型STAT3的PC3细胞及表达N端连接线粒体定位序列的MLS-STAT3的PC3细胞相比较，表现出电子运输链(ETC)中复合物Ⅰ的活动性降低，缺氧条件下活性氧簇量(ROS)的增加。STAT3可能通过增强细胞呼吸电子传递链的活性来参与Ras（原癌基因产物）依赖性的细胞转化[19]。推测线粒体内的STAT3可能通过与细胞呼吸链复合物Ⅰ和Ⅱ相互影响并最终提高NADH，从而增加电子呼吸链的活性和ATP的产生量。然而，活体实验内最佳的ATP的产生量或氧化磷酸化作用并不需要STAT3和蛋白复合物Ⅰ/Ⅱ之间的直接相互作用[20]。故而，我们推测STAT3在线粒体代谢过程中发挥功能可能存在其他的途径，我们以此为出发点进一步探讨。
　　磷酸化修饰主导STAT3从细胞质移位至细胞核，与DNA结合、启动核内催化作用，去磷酸化作用终止上述信号转导过程[21-24]。然而，STAT3在细胞质和线粒体之间通过何种方式传导及其在线粒体中活性逆转的机制仍然未知。有趣的是，参与去除翻译后修饰的线粒体酶可显著促进去乙酰化[25]，从而表明乙酰化修饰在线粒体活动中是一个重要角色。已有报道指出在线粒体内可检测到三个去乙酰化酶SIRTs家庭成员SIRT3、SIRT4和SIRT5的存在[26-28]。蛋白的乙酰化修饰在细胞处于血清饥饿/释放状态中往往起着至关重要的作用，因此我们推测乙酰化修饰可能在线粒体内参与调控能量代谢过程。
　　研究目的：
　　1.研究胰岛素与血清生长因子诱导的STAT3乙酰化修饰对线粒体内物质能量代谢途径的调控及其作用机制。
　　2.研究乙酰化的STAT3在线粒体内能量代谢的调控对癌细胞发生发展的影响。
　　研究方法：
　　1.质粒和截短体的构建构建STAT3 K87R，K685R，K707R，K709R，K685/707/709R点突变质粒，STAT3(28-770)，（1-738），(28-738)，（1-320），（1-585），(465-770)，(685-770)等截短体，确定STAT3作用功能域及位点;将酵母菌氧化酶复合物Ⅳ(Cox4)的核酸序列构建到STAT3羧基端，提高STAT3的线粒体定位。
　　2.免疫共沉淀检测线粒体内与STAT3相互结合相互作用的蛋白。
　　3.转染SiRNA分别干扰细胞内乙酰基转移酶CBP和去乙酰化酶SIRT5的表达。
　　4.蛋白Western Blot分析比较不同处理条件下，不同蛋白在细胞各组分内的表达水平及相应乙酰化修饰程度。
　　5.免疫组化检测STAT3 K685乙酰化在癌组织及正常癌旁组织细胞内的定位。
　　6.质谱分析分析STAT3 C末端乙酰化位点的序列特征;检测细胞因子诱导的STAT3乙酰化位点;检测体外反应中SIRT3或SIRT5对包含K685乙酰化的肽段的去乙酰化水平。
　　7.检测丙酮酸脱氢酶复合物Ⅰ(PDC E1)活性 PDC E1活性检测试剂盒(YoYongBio)采用分光光度法检测不同处理条件下细胞的PDC E1活性。
　　8.检测线粒体膜电势(MMP)水平采用碧云天(Beyotime)线粒体膜电势检测试剂盒（JC-1探针）(C2006)。
　　9.胞内葡萄糖消耗水平检测采用胞内葡萄糖检测试剂盒(Sigma，GAGO-20)。
　　10.油红染色(Oil Red O Staining)着染胞内脂滴，胰岛素或者血清刺激后，光学显微镜下直接观测胞内脂滴的聚集状况。
　　11.Seahorse分析检测不同处理条件下，胞内酸化率(Extracellularacidification rate，ECAR)和氧消耗率(Oxygen consumption rate，OCR)水平。
　　12.α-酮戊二酸(α-KG)水平检测采用α-KG检测试剂盒(Sigma，MAK054)。
　　13.检测胞内乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)水平
　　(1)荧光定量法:采用α-KG检测试剂盒(Sigma，MAK039)。
　　(2) ELISA方法:ELISA试剂盒来源于上海信帆生物科技有限公司。
　　14.乳酸检测采用乳酸水平检测试剂盒（Sigma，MAK064）。
　　15.ATP水平检测采用ATP检测试剂盒(Beyotime，S2006)。
　　16.数据统计学处理 one-way ANOVA分析不同样品结果数据，p＜0.05(*)，p＜0.01(**)认为有统计学意义。
　　实验结果：
　　1.STAT3经胰岛素刺激发生乙酰化修饰，转移进入线粒体
　　细胞因子IL6刺激STAT3多个位点发生乙酰化修饰[7，29，30]，相似地，在血清饥饿的成纤维细胞中，经血清饥饿和释放处理或胰岛素刺激后，同样检测到了STAT3乙酰化的诱导。PC3细胞蛋白的质谱分析结果显示STATs家族中STAT1、STAT3和STAT5的C末端氨基酸序列中K685、K707和K709赖氨酸残基与重要的磷酸化位点705位酪氨酸残基相临[31]，为C末端区域乙酰化位点特有的序列特征。在小鼠成纤维细胞(MEFs)内，经血清饥饿释放激活的STAT3在Y705和S727位点都发生适度的磷酸化，但胰岛素处理后却没有明显检测到磷酸化的存在，但两种处理方式都可以诱导STAT3 C末端乙酰化修饰的发生。293T细胞内，乙酰基转移酶CBP的过表达，尼克酰胺(Nicotinamide，NAM)和曲古抑菌素A(Tricostatin，TSA)均可以诱导STAT3乙酰化。SiRNA敲除小鼠成纤维细胞内的CBP，胰岛素刺激后，却没有明显的STAT3乙酰化现象的发生，而且胰岛素刺激可以增强CBP与胰岛素受体的关联。我们分离出MEF细胞的细胞浆，细胞核和线粒体三部分，只在细胞浆和细胞核两部分检测到了CBP的存在。
　　在蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)或蛋白酶体抑制剂MG132处理的前提下，我们再用胰岛素对MEFs进行处理，实验结果表明胰岛素对于STAT3的表达及稳定性没有明显影响。对小鼠成纤维细胞内经血清饥饿释放处理和胰岛素刺激后各细胞组份内STAT3修饰及定位的变化进行比较，前者可以诱导STAT3同时进入线粒体和细胞核内，后者只表现出诱导STAT3线粒体的移位;只有血清饥饿释放处理诱导S727的磷酸化，但两者都可以诱导STAT3 K685位点乙酰化的发生。STAT3乙酰化可以发生在C末端位点，亦可发生在N端[7，32]。从胰岛素处理的293T细胞内分离提纯STAT3，质谱分析结果显示胰岛素诱导的STAT3乙酰化位点包括N末端结构域的K87位及C末端结构域内的K685、K707和K709。在线粒体外部， HDACs家族的HDAC6使得STAT3 K87去乙酰化[33]，降低STAT3线粒体定位。血清饥饿释放处理诱导的STAT3 Y705和S727位点的磷酸化对STAT3线粒体定位的影响不显著。STAT3（1-738），(28-770)及(28-738)截短体都不会影响STAT3向线粒体内的移位。STAT3及各结构域截短体分别与CBP共转染293T细胞，CBP的过表达明显提高了STAT3 WT、STAT3（1-320）和STAT3（1-585）在线粒体内的定位，但是截去N端结构域的STAT3（321-770）变化不明显，而且STAT3 K87R与STAT3 WT相比，线粒体定位明显降低，即使在血清刺激或者胰岛素处理的条件下也没有改观。
　　2.线粒体内乙酰化的STAT3与PDC E1相结合而激活PDC E1，促进丙酮酸向乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的转化
　　已有报道称，线粒体内STAT3是呼吸链的一个组份，可与电子传递链复合物Ⅰ/Ⅱ和GRIM-19相结合[18，19]。从HeLa细胞线粒体蛋白裂解液内分离纯化STAT3，质谱分析与STAT3相关联的组份。我们的质谱分析没有发现上述已被报道的组份，却惊喜地发现了新的与STAT3结合的线粒体蛋白，包括丙酮酸脱氢酶复合物Ⅰ(PDCE1)、细胞色素C(CytC)和SIRT5。在野生型MEFs细胞内，胰岛素刺激加强了STAT3与PDC E1的结合， PDC E1及其余两种丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酸转乙酰酶(PDC E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(PDC E3)的表达水平没有明显的改变。转染293T细胞，STAT3 C末端结构域参与与PDC E1的结合。在野生型MEFs细胞内胰岛素刺激增强了STAT3与PDC E1的结合，从而提高PDC E1的生物活性，促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A，但是在STAT3-/-MEF细胞内胰岛素刺激对于丙酮酸脱氢酶活性没有明显影响。丙酮酸脱氢酶活性检测试剂盒检测到高表达Cox4-STAT3的细胞的PDC E1比高表达野生型STAT3的细胞表现出更高的生物活性。STAT33KR突变体抑制STAT3与PDC E1的结合，高表达3KR(K685，K707，K709)的STAT3-/-MEFs的PDC E1的活性比高表达WT、Y705和S727A突变体的细胞明显受到抑制。PDC E1负责丙酮酸向乙酰辅酶A的转化，胰岛素刺激后，STAT3 WT MEFs细胞内乙酰辅酶A的水平急剧增高;相反，STAT3-/-MEFs细胞内却没有明显的变化。
　　3.存在于线粒体内的多种去乙酰化酶催化STAT3去乙酰化
　　已有报道称SIRT5是线粒体内的去琥珀酰酶，亦是去乙酰化酶[9，28，34-36]。SiRNA敲除HeLa细胞内Sirtuin家族成员，筛选出针对STAT3的去乙酰化酶。线粒体内可检测到SIRT3、SIRT4和SIRT5的存在，SIRT5的缺失明显增强STAT3的乙酰化程度，SIRT3的缺失也可较小程度发挥STAT3去乙酰化功能。敲除A549细胞内的SIRT5，细胞浆、线粒体和细胞核三部分内STAT3乙酰化水平都相应地增强。为了进一步研究STAT3与SIRT5的结合区域，将全长STAT3、STAT3（1-130）、STAT3(465-770)分别与SIRT5共转染293T细胞，相对于N端截短体(1-130)的微弱结合，C端截断体(465-770)与SIRT5强烈结合。SIRT5 H158Y突变体抑制了SIRT5对STAT3的去乙酰化功能。体外实验显示，SIRT3和SIRT5针对STAT3 K685位点均有去乙酰化的功能，但是SIRT5具有更广泛的去乙酰化功能，SIRT3对于K707和K709位乙酰化没有明显抑制，故而SIRT5是我们研究的重点。线粒体内的去乙酰化酶SIRT3和SIRT5皆可以发挥去乙酰化功能，即使已经有报道称两者在线粒体能量代谢中功能相反[37-40]。
　　4.STAT3的乙酰化调控线粒体内三羧酸-电子传递链(TCA-ETC)的生物功能
　　胰岛素刺激和NAM处理都能较小幅度地提高MEFs细胞的线粒体膜电位，在STAT3-/-MEF细胞内，线粒体基础膜电势和胰岛素刺激后的膜电势相对于野生型MEF都明显降低。我们选择了在17号染色体上STAT3整个基因缺失的前列腺癌细胞株PC3作为研究对象[41]。PC3细胞内，相对于STAT3的突变体Y705F、S727A，STAT33KR对线粒体膜电势的抑制作用更为显著，说明STAT3的乙酰化修饰对线粒体膜电势的影响比磷酸化修饰更为重要[20]。过表达SIRT5可明显抑制因CBP的过表达引起的线粒体膜电势的提升和PDC E1活性的增强。胰岛素刺激条件下，比较野生型和STAT3-/-MEF两种细胞内ATP的合成水平，后者基础水平ATP的合成量比较高，但是在胰岛素刺激前后却没有明显的变化。高表达STAT3各突变体的STAT3-/-MEF细胞的ATP合成量进行比较分析，Y705F对ATP的生成没有明显影响，S727A表现出较小程度的影响，但3KR明显抑制了ATP合成的提高。与STAT3-/-MEF相比较，胰岛素处理后野生型MEFs细胞内葡萄糖的水平迅速下降。Seahorse XF96胞外流量分析仪检测胰岛素处理的MEF细胞的胞外酸化率(Extracellularacidification rate，ECAR)的变化，STAT3的缺失并不影响胞内糖酵解水平，相同的实验过程中，野生型MEF细胞经胰岛素处理后氧消耗率(Oxygenconsumption rate，OCR)明显高于STAT3-/-MEF细胞。检测胰岛素处理后野生型MEF和STAT3-/-MEF细胞内α-KG的水平，我们发现STAT3对于胰岛素引起的TCA循环的上调是必不可少的。分离MEF细胞内细胞浆和线粒体组份，我们发现经胰岛素处理后，两组份内的乙酰辅酶A含量都显著增加。油红燃料对胞内脂滴进行染色，胰岛素促进野生型MEF细胞内脂滴的大量聚集，但是对STAT3-/-MEF细胞作用不明显。与转入STAT3 WT的STAT3-/-MEF细胞相比，转入3KR突变体的细胞没有表现出明显的脂滴堆积。不表达STAT3的前列腺癌PC3细胞表现出很低的PDCE1活性、线粒体膜电势及ATP合成水平，而转染Cox4-STAT3的PC3细胞中PDC E1活性、线粒体膜电势及ATP合成水平都明显升高[42]。肺腺癌细胞A549内表现出连续性高水平STAT3乙酰化，从而在大量表达STAT3的线粒体内，表现出较高水平的PDC E1活性。转入STAT3的PC3细胞大大降低了Warburg效应，乳酸的产生量明显降低，葡萄糖转化成脂肪酸量明显升高。对从非小细胞癌和鳞状细胞癌肺癌患者处获取的肿瘤切片进行免疫组织化学分析，结果显示K685位点的乙酰化广泛分布于细胞质区域，而在正常癌旁组织中只检测到少量K685的乙酰化。为进一步确认细胞质内K685乙酰化主要定位于线粒体，分离肺癌患者癌组织和癌旁组织细胞质和线粒体两组份，免疫印迹实验显示肿瘤组织线粒体内K685乙酰化明显高于癌旁组织，相反，SIRT5的表达水平明显低于癌旁组织，癌组织内ATP的产量也高于正常组织。
　　结论及意义：
　　综上所述，细胞浆内的STAT3，经过胰岛素或血清内的生长因子作用激活后，可以转移进入不同的亚细胞结构内行使不同的生物功能，包括细胞核和线粒体。然而，对于STAT3的线粒体移位及对随后的三羧酸(TCA)循环和电子传递链(ETC)调控的精确机制仍然知之甚少。在血清饥饿的细胞内验证并观察到了经血清释放处理或胰岛素刺激后的STAT3乙酰化过程。血清释放处理或者胰岛素刺激调动CBP乙酰化的STAT3向线粒体移位。在线粒体中，STAT3与丙酮酸脱氢酶E1(PDC-E1)结合而增强PDC E1的生物活性，随后加速丙酮酸转化为乙酰辅酶A，促进TCA循环，提高线粒体膜电势，促进ATP的合成。不同的去乙酰化酶可抑制上述STAT3乙酰化促进线粒体内丙酮酸代谢的过程。HDAC家族成员HDAC6使细胞浆内的STAT3 K87去乙酰化，抑制STAT3向线粒体内的移位。Sirtuin家族成员SIRT5可去乙酰化STAT3，抑制线粒体内丙酮酸代谢的途径。STAT3乙酰化在线粒体内促进丙酮酸代谢从而提高ATP合成的途径，同样适用于分析癌细胞内超常能量的产生。在肺癌A549细胞株中，线粒体内的STAT3表现出连续性的乙酰化，可以在持续性的活性状态中维持癌细胞线粒体膜电位和ATP合成[43-45]，从而为癌细胞的大量增殖提供了能量基础。发现癌细胞的能量供给来源有助于从根本上切断癌细胞发生发展，对于阻遏癌细胞的增殖有极其重要的理论指导意义。

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