高产乳链菌肽基因工程菌株的构建及其发酵条件优化

摘要

乳链菌肽(Nisin)，是由某些乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）在其生长代谢过程中分泌的一种生物多肽类细菌素，具有良好的抑菌效应，对一些食源性腐败菌或有害菌具有强烈的抑制或杀灭作用。长期以来，该抗菌肽主要作为一种安全高效的天然绿色生物防腐剂普遍用于食品加工企业。此外，在医药研究（抗生素替代品、生殖避孕、医学移植、肿瘤研究）及农业饲料等领域也极具广阔的应用前景。
　　而在当前经济与技术条件下，商品化Nisin的生产主要通过微生物发酵方法进行，尚存在工业化产率低，生产成本较高等共性问题。随着生物防腐剂市场需求的日益增大，合理选育Nisin高产菌株，优化其生产菌发酵性能，提高Nisin工业生产的发酵水平，降低发酵生产成本，已然成为亟需解决的问题。尽管采用传统诱变、基因组杂交等微生物筛选技术选育Nisin高产菌株已取得一定效果，但这些方法筛选过程复杂繁琐，工作量较大，获得高产菌株的效率低，而且所获得高产菌株往往容易退化，不足以支持长期稳定的发酵应用。近些年来，随着生物技术的快速发展与应用，Nisin的生物合成基因簇及其代谢调控途径已逐渐得以清晰阐明，越来越多的研究人员尝试基于代谢途径工程技术来构建高效表达Nisin的基因工程菌株，以期望进一步提高Nisin的工业化水平。
　　目前Nisin产生菌的代谢工程改造主要通过对影响Nisin生物合成的相关负调控基因进行敲除或改变其合成途径中特定元件表达水平，或对Nisin的生物合成途径进行异源表达来提高其发酵性能。本论文基于对Nisin生物合成途径中关键基因的功能表达及其调控机制的认识，以乳酸乳球菌ATCC11454基因组DNA为模板，利用PCR扩增获得Nisin生物合成途径中的关键基因nisA（前体基因）ORF和nisRK（调控基因）片段，并通过同源重组技术将nisA ORF和nisRK基因克隆至高拷贝的表达质粒pMG36e中，构建得到重组表达载体pMG36e-nisA和pMG36e-nisA-nisRK。以Nisin产生菌乳酸乳球菌LS01为受体菌，通过电转化和抗性筛选，获得过表达nisA的工程菌株LS01/pMG36e-nisA及联合过表达nisA和nisRK的工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK。摇瓶发酵结果显示，工程菌株LS01/pMG36e-nisA的Nisin效价可达1955 IU/mL，比原始菌株(1472 IU/mL)提高了32.8％;工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK的Nisin效价峰值达到2470IU/mL，比原始菌株提升了67.8％。生物量测定分析表明，工程菌LS01/pMG36e-nisA和LS01/pMG36e-nisA-nisRK的生长状况相对于原始菌株也发生了较明显的变化，其最大生物量相对于原始菌株均略有降低，且后者下降更明显。半定量RT-PCR检测结果表明，目的基因nisA、nisR和nisK在工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK中的转录水平均得到了上调，证实了基因nisA、nisR和nisK的过表达对Nisin的生物合成具有显著促进作用。
　　利用响应面实验设计对工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK进行摇瓶发酵培养基的筛选与优化，以进一步提升工程菌株的发酵性能。结果获得优化后培养基组成为:蔗糖25.06 g/L，玉米浆粉末8.8 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO45 g/L，NaCl2 g/L，MgSO4·7H2O0.3 g/L，CaCO33.5 g/L，Tween-802.7 g/L。摇瓶验证结果表明，优化后工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK的Nisin发酵水平可达到3037IU/mL，比优化处理前提升了23％，比原始菌株产量更是提高了106％。利用所得的最佳发酵培养基与工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK在10L发酵罐中进行分批补料发酵研究，结果表明优产工程菌株在该发酵体系中Nisin发酵效价可达6380IU/mL，比原始生产菌在初始发酵培养基条件中产量提高了46.2％，较大地发挥了工程菌株的发酵潜力。
　　综上所述，利用基因工程手段结合发酵优化不仅可以快速准确筛选到目标高产菌株，克服原始产生菌作为乳链菌肽生产菌的劣势，而且对乳链菌肽的工业化扩大生产及其应用具有重要意义和潜在参考价值。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 生物防腐剂

1．2 乳链菌肽概述

1．2．1 乳链菌肽的结构

1．2．2 乳链菌肽的理化特性

1．2．3 乳链菌肽的生物学活性

1．2．4 乳链菌肽的生物合成研究

1．2．5 乳链菌肚的作用机制

1．2．6 乳链菌肽的检测方法

1．3 高产乳链菌肽发酵菌株的选育研究

1．4 乳链菌肽的工业化研究

1．5 本课题的研究目的与主要内容

第二章 高产乳链菌肽基因工程菌株的构建

2．1 实验材料

2．1．1 菌种和质粒

2．1．2 主要仪器与设备

2．1．3 相关试剂

2．1．4 培养基及溶液的配制

2．2．1 实验流程圈

2．2．2 细菌培养

2．2．3 乳酸乳球菌生长曲线的制定

2．2．4 菌种保藏

2．2．5 分子生物学操作

2．2．7 重组乳酸乳球菌的筛选与鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 乳酸乳球菌LS01生长曲线的制定

2．3．2 乳酸乳球菌ATCCI 1454基因组DNA的提取

2．3．3 目的基因的PCR扩增

2．3．4 重组载体的构建与验证

2．3．5 乳酸乳球菌基因工程菌株的构建与验证

2．4 本章小结

第三章 基因工程菌株的发酵研究

3．1 实验材料

3．1．1 菌种

3．1．2 主要仪器与设备

3．1．3 相关试剂

3．1．4 培养基及溶液的配制

3．2 实验方法

3．2．1 细菌培养

3．2．2 乳链菌肽生产菌株的摇瓶发酵研究

3．2．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．2．4 乳链菌肽生物活性检测

3．2．5 乳酸乳球菌的发酵罐发酵研究

3．2．6 目的基因表达水平检测

3．2．7 基因工程菌株的遣传稳定性实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 基因工程菌株的乳链菌肽发酵能力检测

3．3．2 基因工程菌株的摇瓶发酵动力学研究

3．3．3 乳酸菌球菌的发酵罐发酵研究

3．3．4 目的基因表达水平检测

3．3．5 基因工程菌株的遗传稳定性研究

3．4 本章小结

第四章 基因工程菌株发酵培养基的优化

4．1 实验材料

4．1．1 菌种

4．1．2 仪器与设备

4．1．3 主要试剂

4．1．4 培养基

4．2 实验方法

4．2．1 培养条件

4．2．2 发酵液残糖(蔗糖)的测定

4．2．3 乳链菌肽效价的检测

4．2．4 碳源的筛选

4．2．5 氮源的筛选

4．2．6 Piackett-Burman设计实验

4．2．7 最陡爬坡实验

4．2．8 Box-Behnken实验设计与响应面模型分析

4．2．9 摇瓶发酵验证

4．2．10 发酵罐分批补料发酵实验

4．3 结果与讨论

4．3．2 不同氮源对乳链菌肽发酵的影响

4．3．3 影响乳链菌肽效价的显著性因素筛选

4．3．4 最陡爬坡实验结果

4．3．5 乳链菌肽发酵培养基优化模型的建立

4．3．6 响应面法分析与优化

4．3．7 发酵验证实验

4．3．8 乳链菌肽的发酵罐分批补料发酵实验

4．4 本章小结

总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文