多靶点抗血管新生肽ES2-AF的透明质酸化修饰及修饰物的生物活性、靶向性及药代动力学研究

摘要

内皮抑素(Endostatin，ES)是一个分子量为20 kDa的多肽，最早是从小鼠血管内皮瘤中分离出来的，成为首个被发现的内源性抑制血管新生的细胞外基质片段，同时也是被研究最多的内源性血管新生抑制剂。ES中有一段可高效抑制内皮细胞增殖、迁移的序列ES2（60-70，IVRRADRAAVP），其体内抑制新生血管生成的活性约为完整ES序列的3倍。
　　Anti-flt1肽(GNQWFI，AF)是从位置扫描合成肽组合文库中通过一个包含纯化的重组VEGF及嵌合受体的扫描系统遴选出来的一种VEGFR1选择性的六肽。AF肽可特异地与VEGFR1结合，从而抑制VEGFR1与一系列配体，如VEGFA、VEGFB、PIGF等的相互作用。与其他VEGFR1的单克隆抗体或RNA拮抗剂不同，AF肽是一种能够通过较低生产成本简易合成的非免疫原性的六肽，这些优点决定了其适合在临床应用，但是存在水溶性较差的缺点。
　　透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种从牛眼玻璃体中发现的、带负电荷的、非硫酸化的线性糖胺聚糖，重复二糖单元为β-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸，其生物可降解和高载药性的特点使其广泛应用于医药领域。HA可通过与细胞及细胞间质的受体作用调节肿瘤细胞侵袭、肿瘤细胞的分化、成纤维细胞中病毒的转化、胚胎组织形成等过程。有四种HA特定受体存在于细胞膜表面——CD44、RHAMM(Receptor for HA-Mediated Motility)、IVd4和LEC，这之中在肿瘤部位表达较多的是CD44。
　　AF和ES2在活性方面既有相似又有不同，如果将这两个肽的序列融合在同一个肽中，有望获得更好的生物活性、更好的稳定性和更长的半衰期。为此，我们设计了序列为IVRRADRAAVPGGGGGGNQWFI的肽链，将其命名为ES2-AF，并利用可以靶向肿瘤部位高表达的CD44受体的HA对其进行化学修饰，期待修饰后的多肽溶解性更好、靶向性更强、半衰期更长，从而更好的在体内更好的发挥抗新生血管生成作用。本课题研究内容和取得的主要成果如下:
　　1.ES2-AF的合成与表征
　　采用Fmoc固相合成方法合成了一种ES2-1inker(GGGG)-AF肽，由高效液相色谱进行纯化，纯度均可达95％以上，并进行了结构的确证。
　　2.HA-ES2-AF的合成与表征
　　由于HA溶于水但不溶于有机溶剂，为了下一步的偶联反应，首先用四丁基氢氧化铵对其进行离子交换，形成可溶于DMSO的HA-TBA结合物。HA-TBA分子经卡特缩合剂(BOP)活化羧基后，与ES2-AF、DIPEA（N，N-二异丙基乙胺）反应得到HA-ES2-AF结合物。经1H NMR核磁结果分析表明ES2-AF成功被HA修饰，连接率93.75％，平均每HA链上连结60个ES2-AF肽。
　　3.ES2-AF与HA-ES2-AF的生物活性研究
　　3.1.ES2-AF及HA-ES2-AF的体外抗新生血管生成活性研究
　　(1)采用MTT法评价了抗内皮细胞增殖作用，ES2与ES2-AF在体外均具有抑制内皮细胞增殖的作用，并呈现随浓度增加的趋势。当ES2-AF浓度分别为5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL时，其对内皮细胞增殖的抑制率分别为(11.37％±6.09％)、(13.63％±4.92％)、(17.61％±5.59％)、（16.74％±4.57％）、（27.49％±5.56％）。经HA修饰后的结合物HA-ES2-AF也在体外表现出了一定的抑制内皮细胞增殖的作用，当其肽浓度分别为表5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL时，其对内皮细胞增殖的抑制率分别为（6.67％±4.92％）、(12.01％±8.13％)、（16.96％±5.23％）、（24.37％±8.97％）、(36.40％±7.65％)。
　　(2)采用Transwell小室法测定了抑制内皮细胞转移的作用。以PBS作为空白对照，当药物肽浓度均为200μg/mL时，AF、ES2与ES2-AF三组发生细胞转移的个数分别为（229±11）、（254±4）、（255±13）。AF、ES2与ES2-AF三组药物对于内皮细胞转移都有一定的抑制作用，但是差异不大，说明三组实验药物对于肿瘤转移的抑制作用并没有很大差异。当肽浓度均为200μg/mL时，ES2-AF、HA&ES2-AF混合物、HA-ES2-AF结合物三组发生细胞转移的个数分别为（255±13）、（202±24）、（170±7），HA-ES2-AF表现出了最强的抑制内皮细胞转移的作用，具体机制仍有待进一步研究。
　　(3)利用管腔形成实验研究了ES2-AF、HA-ES2-AF等对内皮细胞EAhy926形成血管的影响。用PBS作为空白对照，AF与ES2在各浓度时抑制体外内皮细胞管腔形成的作用相差不大，但ES2-AF对于内皮细胞管腔的形成的抑制作用明显高于AF和ES2。在肽浓度均为25μg/mL、100μg/mL、200μg/mL时，AF组的节点数分别为(99士19)、(75±17)、(63±12)，ES2组的节点数分别为（67±14）、（72±3）、（61±5），HA-ES2-AF组的节点数分别为(32±3)、（17±6）、(19±5)。由此可见，HA-ES2-AF对内皮细胞管腔形成的抑制作用在所有给药组中是最强的，说明利用HA对多肽的化学修饰提高了其抑制内皮细胞官腔形成的能力。
　　(4)采用ELISA方法根据抗原抗体结合原理测定了AF、ES2、ES2-AF及HA-ES2-AF对于VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合的抑制能力。ES2与ES2-AF均表现出比AF更强的抑制能力，其中ES2-AF的抑制作用略强于ES2。HA-ES2-AF在5μg/mL～200μg/mL范围内的相对值分别为（83.24％士0％）、（55.01％±0.07％）、（51.04％±0.09％）、（41.25％±0.01％）、（37.76％士0.03％），说明HA-ES2-AF对VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合的抑制能力呈浓度依赖性提高。较高浓度时HA-ES2-AF抑制VEGF及其受体VEGFR1（Flt-1）结合的能力明显高于ES2-AF肽。
　　3.2.ES2-AF及HA-ES2-AF的体内抗新生血管生成活性研究
　　在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验中，与生理盐水组进行相比，AF在实验剂量下对CAM血管生成没有明显抑制作用;ES2-AF组在5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL时新生血管面积百分比分别为（32.03％±0.10％）、（22.84％±0.19％）、（19.26％±0.03％），表现出比ES2更高的体内抗血管生成的生物活性并呈现剂量相关。HA与ES2-AF混合物中HA的加入并没有对ES2-AF在动物体内的抑制CAM血管生成产生较大影响。而HA-ES2-AF组在5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL时新生血管面积百分比分别为（9.67％±0.03％）、（10.12％±0.01％）、（13.10％±0.04％），与ES2-AF及混合物组相比抑制CAM血管生成的活性明显提高。
　　4.HA-ES2-AF的靶向能力研究
　　4.1.体外与CD44受体结合能力研究
　　通过表面等离子共振(SPR)技术研究了HA-ES2-AF在体外对肿瘤细胞表面受体CD44的结合能力。以HA为阳性对照，研究了HA-ES2-AF、ES2-AF与CD44蛋白之间的相互作用关系。筛选合适的pH将CD44蛋白锚定于CM5芯片表面，使样品流过芯片，通过Biacore T200的分析软件得出以下三种样品与CD44蛋白结合的KD值:HA为4.198×10l1 mol/L，HA-ES2-AF为4.779×1010 mol/L，ES2-AF为3.011×10-4 mol/L，即样品与CD44结合能力的排列顺序为:HA＞HA-ES2-AF》ES2-AF，经过HA的修饰HA-ES2-AF结合物对细胞表面受体CD44的结合能力较修饰前的肽有十分显著的提升，具有潜在的体内肿瘤部位靶向能力。
　　4.2.体内组织分布研究
　　通过活体成像技术研究了HA-ES2-AF在体内组织分布情况。将ES2-AF与HA-ES2-AF用FITC标记，分别给药于荷黑色素瘤裸鼠，采用小动物活体成像仪进行拍照记录。通过比较发现HA-ES2-AF-FTIC在裸鼠体内分布代谢时间较长，即HA-ES2-AF-FITC的体内血浆半衰期较长，证明了化学修饰有助于增强多肽的稳定性，这与后面药代动力学实验的结果一致;分布于肿瘤部位的药物增多，表明经HA修饰的ES2-AF-FITC在荷瘤裸鼠体内对于肿瘤部位有一定的靶向性，证明了糖基化修饰有助于提高多肽的靶向分布能力，这与SPR实验的结果相符合。
　　5.HA-ES2-AF的药代动力学研究
　　本实验选用Wistar大鼠作为体内药物代谢动力学的模型，通过比较药代动力学参数发现，与ES2-AF相比，HA-ES2-AF在大鼠体内的循环时间明显延长，半衰期由2.79 h延长至18.07 h，平均滞留时间MRT由4.68 h增加至13.18 h，药时曲线下面积AUC0-∞也由2887.80 mg/L·h增大至10694.70 mg/L·h，血浆清除率CL也有所下降。较长时间的维持高血药水平有助于减少给药剂量或降低给药频率。
　　本研究取得的成果和结论主要有:
　　(1)成功固相合成了纯度在95％以上的ES2-AF肽，其体内外抗新生血管生成活性高于ES2或AF。
　　(2)成功完成HA对ES2-AF的化学修饰及结构表征，平均每HA链上连结60个ES2-AF肽。
　　(3) HA-ES2-AF表现出比ES2-AF和HA&ES2-AF混合物更强的抑制内皮细胞增殖与迁移的能力、更强的抑制VEGF与受体结合的能力，以及更强的抑制CAM新生血管生成的能力。
　　(4)利用SPR和活体成像技术发现，HA-ES2-AF比ES2-AF具有更强的CD44结合能力，并表现出一定的体内肿瘤部位靶向性和更长的体内分布代谢时间。
　　(5) HA-ES2-AF的体内半衰期是ES2-AF的6.48倍，有助于减少给药剂量或降低给药频率。

目录

声明

摘要

符号说明

第1章 前言

1．1 内皮抑素及其活性片段

1．1．1 内皮抑素的来源、片段及生物活性

1．1．2 ES及其活性片段的作用机制

1．2 Anti-flt1肽概述

1．3 蛋白质、多肽药物的化学修饰

1．4 本课题研究内容及拟解决的问题

第2章 透明质酸化ES2-AF结合物的合成与表征

2．1 实验试剂与溶液配制

2．1．1 实验试剂

2．1．2 溶液配制

2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．3 HA-TBA的核磁共振一维氢谱(1H NMR)分析

2．3．5 HA-ES2-AF的核磁共振一维氢谱(1H NMR)分析

2．4 实验结果

2．4．1 ES2-AF的合成与表征

2．4．2 HA-TBA的合成及1H NMR谱分析

2．4．3 HA-ES2-AF的合成及1H NMR谱分析

2．5 讨论

2．5．3 HA-ES2-AF的合成与表征

2．6 本章小结

第3章 ES2-AF及HA-ES2-AF的生物活性研究

3．1 实验试剂与溶液配制

3．1．1 实验试剂

3．1．2 溶液配制

3．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 内皮细胞EAhy926的复苏、培养和传代

3．3．2 ES2-AF及HA-ES2-AF的体外抗新生血管生成活性研究

3．3．3 ES2-AF及HA-ES2-AF的体内抗新生血管生成活性研究(鸡胚绒毛尿囊膜实验)

3．4 实验结果

3．4．1 ES2-AF及HA-ES2-AF的体外抗新生血管生成及抗内皮细胞迁移活性研究

3．4．2 ES2-AF及HA-ES2-AF的体内抗新生血管生成活性研究(鸡胚绒毛尿囊膜实验)

3．5 讨论

3．5．2 ES2-AF及HA-ES2-AF的体内抗新生血管生成活性研究(鸡胚绒毛尿囊膜实验)

3．6 本章小结

第4章 HA-ES2-AF的靶向性和药代动力学研究

4．1 实验试剂与溶液配制

4．1．1 实验试剂

4．1．2 溶液配制

4．2 实验仪器设备

4．3 实验方法

4．3．1 体外与CD44结合能力研究

4．3．2 体内对肿瘤组织的靶向性研究

4．3．3 HA-ES2-AF在大鼠体内的药代动力学研究

4．4 结果

4．4．1 HA-ES2-AF在体外与CD44结合能力研究

4．4．2 HA-ES2-AF在体内对肿瘤组织的靶向性研究

4．4．3 HA-ES2-AF在大鼠体内的药代动力学研究

4．5 讨论

4．5．2 HA-ES2-AF在体内对肿瘤组织的靶向性研究

4．6 本章小结

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文