里氏木霉异源蛋白表达及高产纤维素酶菌株的遗传改造

摘要

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）在纤维素底物存在条件下，能够大量合成分泌包括内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶在内的纤维素酶系，实现对底物的高效降解。里氏木霉强大的蛋白合成分泌能力也使其成为异源蛋白表达的良好宿主，对一些需要进行翻译后修饰的蛋白具有突出优势。但里氏木霉中以主要纤维素酶基因cel7a(cbh1)强启动子驱动的蛋白表达依赖于纤维素诱导条件，而此条件下其自身分泌的大量的纤维素酶不利于异源蛋白的后续分离纯化。另一方面，虽然里氏木霉所产纤维素酶目前已实现了规模化生产和应用，但是在生物基燃料如乙醇生产中，纤维素酶的使用成本仍然是一个主要限制因素。因此进一步提升工业菌株的纤维素酶产量对降低转化成本具有重要意义。
　　本论文主要在以下两方面对里氏木霉进行了遗传改造:一是通过对主要的纤维素酶编码基因进行敲除以及对转录因子Xyr1进行过表达，以降低其作为蛋白表达宿主菌株的本底分泌蛋白背景，并且使cbh1启动子驱动的蛋白表达不再依赖于诱导碳源纤维素;二是在里氏木霉高产菌株C10中分别过表达了转录因子Xyr1和β-葡萄糖苷酶Bgl1，进一步提升了C10的纤维素酶产量。主要研究工作总结如下:
　　一、成功构建了主要纤维素酶(Cel5a、Cel7b、Cel6a以及Cel7a)缺失及转录因子Xyr1过表达的两株里氏木霉菌株Δ5a7b6aOExyr1和Δ5a7b6a7aOExyr1，其内源分泌蛋白背景低，且纤维素酶合成不依赖于诱导碳源纤维素，是用于以cbh1启动子驱动异源蛋白表达及纯化的理想菌株。
　　我们以里氏木霉QM9414作为出发菌株，采用基于同源重组原理的基因敲除技术，构建了一株内切酶Cel5a和Cel7b以及外切酶Cel6a同时缺失的菌株Δ5a7b6a，SDS-PAGE分析表明该菌株培养基中分泌蛋白含量明显下降。我们在该菌株中进一步对纤维素酶基因转录正调控因子Xyr1进行了过表达，构建了Δ5a7b6aOExyr1菌株。在非诱导碳源葡萄糖下，该菌株内切酶Cel7a(Cbh1)的合成分泌量与野生型诱导碳源纤维素下相当。这表明，以低背景的Δ5a7b6aOExyr1菌株为表达宿主，可应用于分别在纤维素与葡萄糖条件下以cel7a(cbh1)启动子驱动的异源蛋白表达。我们继而又在该菌株中对cel7a基因进行了敲除，构建了Δ5a7b6a7aOExyr1菌株，在该菌株中可采用随机整合的方式对异源表达基因盒进行较为方便的操作。虽然该菌株由于cel7a的缺失不能利用纤维素作为碳源，但是其可应用于葡萄糖条件下cel7a启动子驱动的异源蛋白表达，并且Cel7a的缺失进一步大幅降低了内源分泌蛋白的背景，能够极大便利目标蛋白的分离纯化。
　　二、以Δ5a7b6aOExyr1作为宿主菌株，成功地表达了来源于特异腐质霉(Humicolo insolens)的内切葡聚糖酶NCE5，CMC酶谱电泳显示该酶的最适pH为6，属于偏中性内切酶。
　　NCE5为来源于H insolens的内切葡聚糖酶，理论分子量为23 kDa。我们根据里氏木霉密码子使用频率对NCE5的编码序列进行优化，并构建了以cel7a(cbhl)启动子驱动的基因表达盒，将其定点整合于Δ5a7b6aOExyr1菌株的cel7a(cbh1)基因位点。CMC酶谱电泳分析表明，该酶成功表达并分泌到胞外，在pH6时CMC酶活最高，属于偏中性内切酶。
　　三、在里氏木霉高产菌株C10中分别过表达了转录正调控因子Xyr1和β-葡萄糖苷酶Bgl1，分析发现发酵液的滤纸酶活分别提升了25％和30％。
　　里氏木霉C10菌株为实验室保藏的纤维素酶高产菌株，在葡萄糖条件下可以低水平地解除碳代谢阻遏。我们在C10中采用tcu-1强启动子对转录正调控因子Xyr1进行过表达，获得C10-OExyr1菌株。该菌株与C10相比，不仅发酵液的滤纸酶活提升了约25％，并且纤维素酶分泌时间提前12h。在C10中以cel7a启动子过表达β-葡萄糖苷酶基因bgl1，获得C10-bgl1菌株，该菌株发酵液的滤纸酶活比野生型提升约30％。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

第一章 绪论

1．1 里氏木霉及其所产纤维素酶

1．2 里氏木霉作为表达宿主

1．2．1 异源蛋白表达的里氏木霉菌株

1．2．2 里氏木霉中异源蛋白表达策略

1．3 里氏木霉纤维素酶产量提升策略

1．3．1 转录水平改造

1．3．2 异源／同源基因表达和基因敲除

1．3．3 蛋白质水平改造

1．3．4 启动子改造

1．4 论文立体依据及研究内容

第二章 主要纤维素酶缺失及转录因子Xyr1过表达菌株构建及性状分析

2．1 材料和试剂

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 引物及序列

2．1．3 主要试剂及仪器

2．1．4 培养基

2．2 实验方法

2．2．1 菌种及质粒保存方法

2．2．2 大肠杆菌质粒提取，DNA片段凝胶回收，酶切产物纯化，丝状真菌基因组提取

2．2．3 里氏木霉原生质体转化及转化子验证

2．2．4 菌株培养方法

2．2．5 SDS-PAGE电泳

2．2．6 Gateway敲除系统

2．2．7 生物信息学分析方法

2．3 结果与讨论

2．3．2 主要纤维素酶基因缺失菌株构建及验证

2．3．3 主要纤维素酶基因缺失菌株不同碳源平板生长检测

2．3．4 主要纤维素酶基因缺失菌株发酵液上清SDS-PAGE检测

2．3．5 Δ5a7b6aOExyr1菌株构建

2．3．6 Δ5a6a7b7a和A5a6a7b7OExyr1菌株的构建

2．4 小结与讨论

第三章 中性内切纤维素酶HiNce5的表达

3．1．1 菌株和质粒

3．1．2 引物及序列

3．1．3 主要培养基

3．2 实验方法

3．2．1 酶活测定

3．2．2 里氏木霉转化及培养方法

3．2．3 CMC酶活测定酶谱电泳法

3．3 结果与分析

3．3．2 Δ5a7b6aOExyr1-nce5转化子验证

3．3．3 HiNce5活性检测

3．3．4 HiNce5的表达对里氏木霉总内切酶最适pH的影响

3．3．5 HiNce5在纤维素酶高产菌株C10中的表达

3．4 本章小结

第四章 C10菌株遗传改造及纤维素酶产量分析

4．1 材料和试剂

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 引物及序列

4．1．3 主要培养基

4．2 实验方法

4．2．1 真菌转化及培养方法

4．2．2 western-blot方法

4．3 结果及分析

4．3．1 C10-OExyr1菌株构建及纤维素酶产量分析

4．3．2 C10-bgl1菌株构建及纤维素酶产量分析

4．3．3 OExyr1Δtul1菌株构建及纤维素酶产量分析

4．4 本章小结

全文总结与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢