CBMs功能架构分析及糖苷水解酶TrCel12A热稳定性机理研究

摘要

纤维素类生物质的高效转化利用是解决资源错置、环境污染与能源缺乏的重大课题，具有重要的现实意义。大部分天然纤维素降解酶都具有催化模块(CDs)、碳水化合物结合模块(CBMs)。CBMs具有识别和结合底物的功能，辅助CDs对底物的催化水解。设计获得高效纤维素降解酶有两大策略，第一提高纤维素酶蛋白对纤维素类底物的结合力，可以通过增加CBMs模块的数量和提高CBMs和CDs对底物的结合力来实现;其次，设计提高酶蛋白整体结构的热稳定性。生物炼制产业采用高温生产环境，能够加快反应速度并减少杂菌污染，因此需要高热稳定性的酶蛋白提高降解效率并降低生产成本。
　　GH12家族的TrCel12A是只有一个CD模块的嗜中温内切纤维素酶，只有234个氨基酸，结构简单，具有很大的改造空间。鉴于定向筛选的不确定性以及长时耗，本文综合生物信息学分析手段与分子动力学模拟研究策略，对不同结合模式的CBMs家族进行了功能架构分析，来筛选适合与TrCel12A重组的CBMs模块;运用分子动力学模拟探宄该酶的热稳定性机制，定位潜在的突变靶点，并设计了四个突变期望提高该糖菅水解酶的热稳定性。计算方法和实验方法的结合大大减少了实验测定的工作量。本文主要内容及研究结果如下:
　　(1) CBMs能够自主折叠并发挥功能，在CAZy数据库中，序列相似度30％以上的CBMs被归于同一CBMs家族，具有相似的结构特征。对三种不同结合模式的7个CBMs家族进行功能架构分析，对研究CBMs的功能混杂性和理性设计提高CBMs结合力都具有重要理论价值。本文研究发现，CBMs功能架构处偏好芳香族氨基酸(W、Y)和极性氨基酸(Q、R、N)，结合模式不同的CBMs对酸碱氨基酸的偏好不同，这是CBMs识别底物的分子基础;不同家族在功能架构处采用增加亚位点数量或增加亚位点上的氨基酸数量来保障对底物的结合能力;功能架构序列谱表明不同CBMs家族具有不同数量的底物结合亚位点，而且与CDs相比，保守氨基酸数量相对较少，通常为芳香族氨基酸(W、Y)和弱极性氨基酸(N、Q)，大部分分布在A型CBMs中;不同CBMs家族功能架构上的绝对保守氨基酸、相对保守氨基酸和可变氨基酸识别碳水化合物底物糖环上各羟基氧原子的模式各不相同，从而不同CBMs家族可对结构相近的碳水化合物底物进行部分识别，这可能是不同CBMs家族产生功能混杂性的分子基础。
　　(2)应用分子动力学模拟分析TrCel1A的热稳定性的影响因素。本文使用Gromacs软件模拟溶剂环境，并设置了四个温度梯度(300K、350K、400K、500K)对TrCel1A进行分子动力学模拟。分析RMSF值发现蛋白的柔性分布是不均匀的，蛋白的N末端和活性中心是高柔性位点;四个位于不同二级结构上的N末端突变的分子动力学模拟结果表明，引入大的疏水基团(G41F)以及引入带电基团(Q6K)等方式能够增强N末端内部的相互作用，从而提高酶蛋白整体的结构稳定性;S25P通过引入内酰胺环的方式降低了α-螺旋的柔性，但是降低单个二级结构的柔性没有提高整体蛋白的热稳定性。
　　(3)N末端突变对TrCel1A热稳定性的影响的实验验证。使用大肠杆菌表达体系表达出四个突变体蛋白，在50℃、55℃、60℃进行热稳定性检验，G41F和Q6K在55℃和60℃下的酶活性高于野生型。DSC测定出的Q6K和G41F的Tm值比野生型高，证明G41F和Q6K提高了蛋白的热稳定性。这说明稳定N末端结构是提高纤维素酶热稳定性的有效方式以及分子动力学模拟方法的高效与可靠。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 蛋白质结构、动态与功能

1．1．1 蛋白序列、结构与功能

1．1．2 蛋白动态、功能与稳定性

1．2 纤维素酶生物信息学研究进展

1．2．1 催化模块

1．2．2 碳水化合物结合模块

1．3 纤维素酶相关计算模拟研究进展

1．3．1 分子动力学模拟简介

1．3．2 分子动力学模拟在纤维素酶研究中的应用

1．4 立题依据

第二章 CBMs功能架构生物信息学分析

2．1 材料与方法

2．1．1 生物信息学分析软件与网站

2．1．2 数据获取及筛选

2．1．3 序列比对与结构比对

2．1．4 氨基酸频率统计

2．1．5 功能架构序列谱构建与稳定性检验

2．2 结果与分析

2．2．1 CBMs结合位点氨基酸频率与偏好性

2．2．2 CBMs亚位点和氨基酸数量统计分析

2．2．3 CBMs结合位点序列谱特征分析

2．2．4 CBMs功能混杂性的分子机制分析

2．3 小结与讨论

第三章 应用分子动力学模拟探究糖苷水解酶TrCel12A的热稳定性机理

3．1 分子动力学模拟流程

3．1．1 构建模拟体系

3．1．2 模拟参数设置与模拟计算

3．1．3 模拟体系收敛性检验

3．1．4 波动均方根分析

3．1．5 回旋半径分析

3．1．6 氢键分析

3．1．7 溶剂可及表面面积分析

3．1．8 蛋白质二级结构分析

3．1．9 体系能量计算

3．2 虚拟突变与突变方向筛选

3．3 结果与讨论

3．3．1 模拟体系收敛检验结果

3．3．2 糖苷水解酶TrCel12A的柔性分析

3．3．3 蛋白N末端结构柔性分析

3．3．4 突变对蛋白整体结构稳定性的影响

3．3．5 突变对蛋白N末端结构稳定性的影响

3．4 小结

第四章 N末端突变对TrCel12A的热稳定性影响的实验分析

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 主要的仪器及试剂

4．1．3 主要的培养基

4．1．4 主要引物

4．1．5 纤维素酶EGⅢ大肠杆菌原核表达体系的构建

4．1．6 突变质粒的构建

4．1．7 大肠杆菌BL21异源表达突变蛋白及纯化

4．1．8 差示扫描量热法(DSC)测定突变蛋白熔化温度Tm

4．1．9 温度耐受性检测

4．2 结果与讨论

4．2．1 突变对蛋白催化活性的影响

4．2．2 突变对蛋白结构热稳定性的影响

4．3 小结

全文总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文