P--STAT6/Tim--3在调节肿瘤相关巨噬细胞极化并抑制膀胱癌进展中的作用及机制

摘要

膀胱癌是临床常见的泌尿系统恶性肿瘤疾病之一，当前，膀胱癌肿瘤微环境相关的免疫治疗是该领域的研究热点，但其作用机制尚未完全阐明。所以，深入研究膀胱癌的肿瘤微环境以及调节肿瘤增殖及侵袭的机制，寻找治疗膀胱癌的新靶点，仍然是当前膀胱癌研究的重点。 肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophage，TAM)是指浸润到癌组织周围并迁移至肿瘤基质内的巨噬细胞。巨噬细胞主要有两种极化类型:M1型和M2型。M1型为经典活化型，主要表现为促炎及抗肿瘤活性;M2型为替代活化型，主要表现为抗炎及促肿瘤活性。TAM主要为M2型，其促进肿瘤疾病进展的能力可能与诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)有关。近期研究表明，信号转导和转录活化因子6（Signal transducers and activators of transcription6，STAT6）及T细胞免疫球蛋白及粘蛋白3(T-cell immunoglobulin and mucin domain3，Tim-3)的表达均在TAM的M2极化及肿瘤疾病进展中具有重要作用且密切相关。 STAT6具有转录激活功能，激活后可形成磷酸化STAT6(Phosphorylated STAT6，P-STAT6)并转入细胞核内启动靶基因表达。乳腺癌研究表明，STAT6磷酸化与巨噬细胞M2极化密切相关;STAT6抑制剂AS1517499能够通过靶向阻断STAT6磷酸化，抑制荷瘤裸鼠乳腺癌的生长及转移。近期研究表明，Tim-3是一个抑制性免疫检查点分子，它可以在肿瘤微环境中发挥免疫抑制功能，诱导肿瘤产生免疫逃逸。另有研究表明，Tim-3在TAM中呈现高表达，并且可能参与TAM的M2极化，促进肿瘤疾病进展，其表达水平受上游STAT6磷酸化激活的调节。关于P-STAT6/Tim-3的研究文献表明，巨噬细胞STAT6磷酸化可以影响Tim-3的表达;细胞因子白细胞介素-4(Interleukin4，IL-4)可以通过活化单核细胞中的转录因子STAT6，并通过激活Tim-3基因启动子，调节Tim-3的基因转录和表达。以上研究表明，P-STAT6/Tim-3介导的肿瘤相关巨噬细胞的M2极化与恶性肿瘤的免疫逃逸及疾病进展密切相关。 已有研究表明，在膀胱癌的肿瘤微环境中，M2型TAM的浸润程度与膀胱癌的不良预后紧密相关。我们前期研究发现，STAT6及Tim-3在膀胱癌组织中的高表达与膀胱癌的疾病进展密切相关，但其具体作用机制尚不明确。STAT6及Tim-3是否通过介导膀胱癌肿瘤微环境中TAM的M2极化影响膀胱癌的疾病进展，目前未见相关研究。因此，我们推测P-STAT6/Tim-3在调节肿瘤相关巨噬细胞M2极化并影响膀胱癌疾病进展中起到重要作用，通过AS1517499阻断巨噬细胞STAT6磷酸化可能抑制肿瘤相关巨噬细胞介导的膀胱癌增殖、迁移及侵袭。 研究目的: 研究P-STAT6/Tim-3在膀胱癌中影响肿瘤相关巨噬细胞M2极化并调控膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用机制。 研究方法: 1、P-STAT6/Tim-3在THP-1细胞极化为M2型巨噬细胞中的作用及机制研究 将THP-1细胞采用相应细胞因子分别诱导为M0、M1、M2巨噬细胞，记录细胞形态改变;采用Western blotting、流式细胞术，鉴定M0、M1及M2表型，检测不同浓度AS1517499对M1、M2极化的影响，检测STAT6、P-STAT6、Tim-3在巨噬细胞M1、M2极化中的表达;CCK-8实验检测不同浓度AS1517499对THP-1细胞的毒性作用。 2、膀胱癌细胞通过激活P-STAT6/Tim-3诱导巨噬细胞M2极化的机制研究 以巨噬细胞M0及膀胱癌细胞T24、5637作为研究对象，实验共分5组:M0组;T24+M0组;T24+M0+AS1517499组;5637+M0组;5637+M0+AS1517499组。AS1517499药物浓度设为100nM。观察各组巨噬细胞形态改变;采用CCK-8实验检测不同浓度AS1517499对膀胱癌细胞的毒性作用;采用Western blotting检测CD163、Arg-1以及STAT6、P-STAT6、Tim-3的表达;采用流式细胞术鉴定各组细胞M1、M2表型改变;ELISA检测膀胱癌细胞分泌细胞因子IL-4、IL-13、IFN-γ以及TNF-α的表达。 3、AS1517499通过抑制巨噬细胞M2极化降低膀胱窟增殖及侵袭的研究 以巨噬细胞M0及膀胱癌细胞T24、5637作为研究对象，实验各分4组。T24细胞分组为:T24、T24+M0、T24+M0+AS1517499;T24+AS1517499。5637细胞分组为:5637;5637+M0;5637+M0+AS1517499;5637+AS1517499。AS1517499药物浓度设为100nM。观察膀胱癌细胞形态改变。膀胱癌细胞的增殖以CCK-8实验进行检测;膀胱癌细胞的迁移及侵袭能力采用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移/侵袭实验检测。采用Western blotting检测各组膀胱癌细胞EMT相关指标E-cadherin、Vimentin、N-cadherin及Ki-67的表达。 研究结果： 1、THP-1细胞可通过P-STAT6/Tim-3激活极化为M2型巨噬细胞 (1)THP-1细胞发生M1、M2极化后细胞形态由小圆形变为长梭形及多边形。 (2)Western blotting结果表明CD80、iNOS在M1组高表达，CD163、Arg-1、P-STAT6及Tim-3在M2组高表达。 (3)流式细胞术结果表明，CD80、IL-6在M1组高表达，CD206、IL-10在M2组高表达。 (4)不同浓度AS1517499使CD163、Arg-1、P-STAT6及Tim-3表达相应降低。 (5)药物浓度为10nM、100nM时，对THP-1细胞活力无明显影响;浓度为300nM时，细胞活力出现明显下降。综合评估，AS1517499的合适药物浓度是100nM。 2、膀胱癌细胞可通过激活P-STAT6/Tim-3诱导巨噬细胞M2极化 (1)与膀胱癌细胞共培养48h后，THP-1细胞形态由小圆形变为长梭形及多边形。 (2)CCK-8实验结果表明，AS1517499(10nM、100nM、300nM)对膀胱癌细胞无明显毒性作用。 (3)Western blotting结果表明，CD163、Arg-1、P-STAT6及Tim-3在T24+M0、5637+M0共培养组表达升高;在T24+M0、5637+M0共培养组中加入AS1517499(100nM)后，CD163、Arg-1、P-STAT6及Tim-3表达降低。 (4)流式细胞术结果表明CD206、IL-10在T24+M0、5637+M0共培养组表达升高;在T24+M0、5637+M0共培养组中加入AS1517499(100nM)后，CD206、IL-10表达降低。 (5)ELISA结果表明AS1517499（100nM）对膀胱癌细胞中IL-4、IL-13、IFN-γ及TNF-α的表达无明显影响。 3、AS1517499可以通过抑制巨噬细胞M2极化降低膀胱癌细胞的增殖、侵袭 (1)与M0巨噬细胞共培养48h后，膀胱癌细胞T24、5637的细胞形态由近似圆形变为长梭形，细胞间隙变大。 (2)CCK-8实验结果表明，T24+M0、5637+M0共培养组膀胱癌细胞增殖能力较T24、5637细胞单独培养组显著增加;加入AS1517499(100nM)后，膀胱癌细胞增殖被抑制。 (3)细胞划痕实验、Transwell细胞迁移/侵袭实验结果表明，T24+M0、5637+M0共培养组膀胱癌细胞迁移/侵袭能力较T24、5637细胞单独培养组显著增加;加入AS1517499(100nM)后，迁移/侵袭能力被抑制。 (4)Western blotting结果表明，与对照组相比，T24+M0、5637+M0共培养组EMT相关指标Vimentin、N-cadherin及Ki-67表达显著升高;加入AS1517499(100nM)后，EMT相关指标Vimentin、N-cadherin及Ki-67表达下降。 研究结论： (1)膀胱癌细胞可通过激活巨噬细胞P-STAT6/Tim-3诱导巨噬细胞发生M2极化;M2型巨噬细胞可以促进膀胱癌细胞EMT，促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。 (2)AS1517499可以通过阻断巨噬细胞P-STAT6/Tim-3，抑制肿瘤相关巨噬细胞M2极化，降低膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭。 (3)肿瘤相关巨噬细胞P-STAT6、Tim-3的表达具有一致性，且与膀胱癌的组织学分级、临床分期及Ki-67表达相关。

目录

声明

摘要

符号说明

第四章 正文：P-STAT6／Tim-3在调节肿瘤相关巨噬细胞极化并抑制膀胱癌进展中的作用及机制

第一节 前言

第二节 P-STAT6／Tim-3在THP-1细胞极化为M2型巨噬细胞中的作用及机制

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第三节 膀胱癌细胞通过激活P-STAT6／Tim-3诱导巨噬细胞M2极化的机制研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第四节 AS1517499通过抑制巨噬细胞M2极化降低膀胱癌细胞增殖及侵袭的研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第五节 AS1517499抑制巨噬细胞M2极化降低膀胱癌异体移植瘤增殖的实验研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第六节 肿瘤相关巨噬细胞P-STAT6、Tim-3的表达关系及在膀胱癌中的临床意义

1．研究对象与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第七节 研究总结论

第八节 附图

第九节 附表

参考文献

第五章 综述肿瘤相关巨噬细胞极化在肿瘤治疗中的研究进展

致谢

附录