LncRNA-MEG3在非小细胞肺癌中低表达提示预后不良：GEO数据分析及机制研究

摘要

研究目的：
　　LncRNA大小超过200nt，缺乏蛋白质编码能力。目前已经确定了14，880个人类lncRNAs，LncRNAs是聚合物Ⅱ(polⅡ)的产物，绝大多数均被封闭，聚腺苷酸化和频繁剪接。转录谱分析研究逐渐揭示了lncRNAs在人类的各类疾病中的作用。在癌症领域，与相应的正常组织相比，lncRNA表达在肿瘤细胞和组织中出现了显著的失调，并广泛参与了肿瘤细胞的恶性转化、谱系特异性改变、基因拷贝数变化和表观遗传修饰等生物学过程。研究发现其对肿瘤细胞株的增殖和凋亡，以及细胞周期和细胞代谢，细胞侵袭转移等一系列行为产生调控。
　　人母系表达基因3(maternallyexpressedgene3，MEG3)，是重要的癌症相关lncRNA之一，也被称为GTL2，最初被确定在远端小鼠12号染色体上，MEG3定位于人类染色体14q32，长度约1.6kb，产生各种替代剪接的转录本。与它的小鼠同系物类似，MEG3的表达和调控对胚胎形成以及生长发育至关重要。在人垂体肿瘤、宫颈癌、尿路上皮癌、前列腺癌等类型的肿瘤中纷纷检测到MEG3的表达缺失，高度提示MEG3可能作为抑癌基因在肿瘤的各个生物学过程中发挥作用。
　　在对不同类型的肿瘤的研究中发现，MEG3多数发挥其抑癌作用，其高表达可诱导肝癌细胞生长停滞，促进肝癌细胞的凋亡，还可抑制乳腺癌细胞的过度增殖，降低其恶性程度，在甲状腺癌中也发现MEG3的表达缺失与其恶性转化有关。
　　本文旨在对MEG3与非小细胞肺癌患者预后的相关性及机制进行了系统的研究论述;第一部分:选取GEO数据库中临床病理参数，进行研究分析，发现非小细胞肺癌中长链非编码RNA-MEG3低表达提示预后不良;第二部分:基础实验，揭示MEG3在非小细胞肺癌中的表达情况及其生物学行为，从而进一步论证分析MEG作为抑癌基因机制;第三部分:对长链非编码RNA-MEG3与肿瘤的国内外最新研究进展进行综述。从临床数据、基础研究、研究进展三方面，对MEG3进行综合研究，探讨非小细胞肺癌中MEG3表达与预后的关系，以期为癌症诊断，治疗和预后寻找到一个潜在靶点。
　　一、非小细胞肺癌中长链非编码RNA-MEG3低表达提示预后不良:GEO数据研究分析
　　1.研究方法：
　　本研究从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库(Affymetrix U133Plus2.0platform)中获得7个总计1144名患者的子数据集。以SPSS22.0软件使用卡方检验测试MEG3的表达和年龄，吸烟指数，性别，组织学，分期，吸烟状况，种族和辅助治疗等其他变量之间的关联。以Kaplan-Meier生存分析探索MEG3表达与总生存期/无进展生存期之间的关联。对影响患者OS和PFS的临床病理数据进行单变量Cox比例危险回归分析，在单变量Cox回归分析中对P＜0.05的变量进行多元回归分析;对年龄，性别，组织学，分期，种族，吸烟状况和辅助化疗等变量进行亚组分析。以STATA12.0软件对7组数据集进行meta分析以进一步探究MEG3表达对患者预后的影响，应用随机效应模型对风险比进行了估计，以风险比和95％置信区间(95％confidence interval，95％CI)绘制森林图，并将每个数据集对汇总结果的影响进行了敏感性分析，最后以Egger测试进行出版偏倚评估。以P＜0.05为差异具有统计学意义，详细分析MEG3在各数据集中及汇总后与NSCLC患者OS/PFS的相关性。
　　2.研究结果:
　　GEO数据库中患者MEG3表达与患者临床病理参数的相关研究中发现，MEG3的差异表达与患者临床分期(GSE31210OS和GSE31210PFS)，组织学(GSE29013OS和GSE29013PFS)和性别(GSE29013PFS)有关。进一步分析MEG3与患者OS/PFS的相关性后发现，在GSE3141(P=0.039)，GSE30219(P=0.008)中患者的OS和GSE30219(P=0.048)中患者PFS与MEG3的表达水平相关。MEG3低表达与GSE31210数据库患者OS缩短有一定关联(P=0.050)。在GSE3141OS、GSE30219OS、GSE31210OS、GSE37745OS、GSE50081OS、GSE29013PFS、GSE30219PFS、GSE31210PFS和GSE37745PFS中，MEG3高表达组NSCLC患者的五年生存率较MEG3低表达组均明显提高。
　　3.研究结论:
　　MEG3的表达受到患者临床分期、组织学以及性别等因素的影响，非小细胞肺癌患者中常出现MEG3的表达抑制或者缺失，患者的总生存期或无进展生存期缩短与MEG3下调密切相关，尤其在年轻患者（≤60岁）中MEG3低表达与不良预后的关系十分显著，MEG3可以作为影响非小细胞肺癌患者预后的一个新型生物标记物。考虑到回顾性研究的弱点，有必要进行前瞻性研究进一步论证。需要更深入的探索来阐明MEG3高表达在肿瘤抑制中的的作用机制。
　　二、MEG3在非小细胞肺癌中的表达及其生物学行为研究
　　1.研究方法:
　　在我们的前期研究中利用多个GEO数据集证实MEG3在肺癌中下调，并与不良预后相关，但机制不明。故后期，依托于山东省立医院肿瘤组织数据库，我们通过数据管理系统，从山东省立医院2011-2012年入院行肺癌切除术，并保存有冰冻组织的患者中随机选取了40例患者，均为非小细胞肺癌患者，并获得其冰冻肿瘤组织及匹配正常组织;同时选取人肺腺癌细胞系A549（购自于美国模式培养物集存库）;我们利用肺癌肿瘤组织及匹配正常组织，通过实时定量PCR探索MEG3在肺癌及正常组织中的表达;质粒转染，MEG3在A549细胞过表达，siRNA转染敲除A549细胞中的MEG3，然后SRB法检测细胞增殖，AnnexinⅤ-FITC/PI法检测细胞凋亡，溴化乙锭(PI)法检测细胞周期，划痕实验检测迁移，免疫印迹杂交实验(Western blotting)检测MEG3对部分EMT指标的影响;从而探索MEG3在非小细胞肺癌中的生物学功能。
　　2.研究结果：
　　通过检测肺癌组织及匹配正常组织中MEG3的相对表达量，在大部分患者肿瘤组织中MEG3的表达明显低于正常组织(p＜0.0001);通过SRB实验及AnnexinⅤ-FITC/PI法检测肺癌细胞增殖及凋亡，证实过表达MEG3能够明显抑制A549细胞增殖，促进其凋亡，而敲除MEG3能在一定程度上促进A549细胞增殖，但对凋亡没有产生影响;过表达MEG3引起了明显的G0/G1期细胞阻滞(p=0.02)，但对G2/M期没有明显影响;通过划痕实验证实，在过表达MEG3后，细胞的迁移作用明显被抑制;通过实时定量PCR发现MEG3上调后上皮性指标CDH1出现了明显的上调，但间质性指标CDH2及VIM出现了明显的下调;SNAI1、SNAI2作为上皮间质转化的转录因子出现了明显的下调;而TGFB1下调最为明显。但血管生成指标VEGFA、VEGFB、KDR等变化不明显，MMP3、MMP9也出现了一定程度的下调;Western blotting实验显示当敲除MEG3后，PDGFRA、PDGFRB出现了明显的上调，Snail1、Snail2、CDH2及KDR15等EMT相关指标出现明显上调，进一步证实MEG3在EMT中的重要作用。
　　3.研究结论：
　　本研究通过实时定量PCR检测MEG3在肿瘤及匹配正常组织中的表达证实MEG3在NSCLC肿瘤及正常组织间存在表达差异，其在肿瘤中的表达明显低于正常组织;MEG3能够影响NSCLC细胞的周期，引起周期抑制;MEG3能够抑制增殖，促进肿瘤细胞的凋亡;MEG3在NSCLC上皮间质转化及血管生成中发挥重要作用。
　　三、长链非编码RNA-MEG3与肿瘤
　　我们对国内外长链非编码RNA-MEG3最新的研究进展，进行了系统的综述，包括:、MEG3的调控机制、MEG3与癌症、MEG3与非小细胞肺癌、MEG3在癌症治疗中的前景、价值及可能性。从而进一步验证总结我们前期的临床研究及实验研究结果。结论:LncRNA的功能多样，作用机制复杂，需进一步进行研究探讨;MEG3与各种癌症的临床病理学结果密切相关;MEG3的表达缺失或降低在人类癌症中十分常见，但MEG3多数情况下是一种基于RNA的肿瘤抑制因子，参与了肿瘤的病因和进展等的反应，其活性通过TP53依赖性和TP53独立过程介导;MEG3可与许多肿瘤相关基因（包括TP53，MDM2，GDF15，Rb1和TGF-β）相互作用;其在正常和不同级别癌症之间的差异表达，使MEG3可以成为评估癌症的分期和预后的生物标志物。
　　四、全文总结
　　通过以上GEO数据库临床病理参数研究、基础研究、综述国内外长链非编码RNA-MEG3研究进展，可以得出最终结论:长链非编码RNA-MEG3在非小细胞肺癌中低表达提示预后不良，MEG3是抑癌基因，可作为癌症诊断，治疗和评估预后的潜在靶点;同时，随着实时定量PCR，微阵列，下一代测序等的现代科研技术的进步，廉价的费用，可以在临床广泛应用，为临床诊疗和随访提供指导。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：非细胞肺癌中长链非编码RNA-MEG3低表达提示预后不良：GEO数据研究分析

前言

数据资料与方法

研究结果

讨论

结论

附表及附图

参考文献

第二部分：MEG3在非小细胞肺癌中表达及其生物学行为研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附图

参考文献

第三部分 长链非编码RNA MEG3与肿瘤

前言

参考文献

致谢

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