HBV相关肝细胞癌和慢加急性乙型肝炎肝衰竭前期UBE2Q1基因甲基化状态及临床意义

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一部分 血清UBE2Q1基因甲基化在肝细胞癌诊断中的临床价值
　　目的：
　　通过检测乙肝病毒相关肝细胞癌患者(HBV related hepatocellular carcinoma，HBV-related HCC)，乙肝病毒相关肝硬化患者(HBV-related liver cirosis，HBV-related LC)，慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B，CHB)及健康志愿者(Health controls，HCs)外周血清cfDNA中泛素结合酶UBE2Q1基因的甲基化状态，分析乙肝病毒相关肝细胞癌患者泛素结合酶UBE2Q1基因的甲基化状态与临床资料间的相关性，探讨UBE2Q1基因甲基化状态作为诊断乙肝病毒相关肝细胞癌血清学标志物的可行性。
　　方法：
　　选取2015年7月至2016年7月在山东大学齐鲁医院就诊的HBV-related HCC患者80例，HBV-related LC患者40例，CHB患者40例。HCs20例作为临床对照。采用甲基化特异性PCR检测各组研究对象血清UBE2Q1基因的甲基化率。卡方检验比较各组UBE2Q1基因的甲基化率。卡方检验和spearman相关系数分析HBV-related HCC患者UBE2Q1基因的甲基化状态与临床指标之间的相关性。ROC曲线分析UBE2Q1基因的甲基化状态以及联合血清AFP水平在诊断HBV-related HCC中的价值。
　　结果：
　　1.HBV-related HCC组血清UBE2Q1基因甲基化率为33.75％(27/80)，HBV-related LC组，CHB组及HCs组血清UBE2Q1基因甲基化率分别为55.00％(22/40)、60.00％(24/40)和65.00％(13/20)。HBV-related HCC组的甲基化频率明显低于HBV-related LC组(x2=4.98，P=0.026)，CHB组(x2=7.52，P=0.006)和HCs组（x2=6.51，P=0.011）。而HBV-related LC组，CHB组及HCs组之间甲基化频率无明显异常。
　　2.肿瘤TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的患者血清UBE2Q1甲基化率低于分期Ⅰ/Ⅱ期的患者(x2=4.68，P=0.030);肿瘤直径＞3厘米的患者血清UBE2Q1甲基化率低于肿瘤直径≤3厘米的患者(x2=5.09，P=0.024)。Spearman相关分析显示血清UBE2Q1甲基化率与TNM分期呈明显的负相关(rs=-0.30，P=0.008)，与肿瘤直径大小的相关系数rs=-0.20，P=0.080。HBV-related HCC患者血清UBE2Q1甲基化率与其他临床指标如性别，年龄，HBeAg状态、CTP评分(Child-Turcotte-Pugh score，CTP score)和是否有门静脉入侵无明显的相关性，P＞0.05。
　　3.利用血清UBE2Q1基因甲基化状态区分HCC患者与LC和CHB患者的敏感性66.30％，特异性57.50％，ROC曲线下面积(Area under ROC curve，AUC)0.619，95％可信区间(CI)0.532-0.706。单独利用血清AFP水平区分HCC患者与LC和CHB患者的敏感性53.80％，特异性87.50％，AUC0.668，95％CI0.581-0.755。ROC曲线给出的AFP诊断分界是192.15ng/ml。我们将20ng/ml作为AFP阳性的截断值，血清UBE2Q1甲基化状态联合AFP水平诊断肝癌的敏感性58.8％，特异性75.0％，AUC0.720，95％CI0.641-0.799。在此基础上，我们进一步分析AFP截断值分别为200ng/ml和400ng/ml时，联合UBE2Q1甲基化状态与AFP水平在肝癌诊断中的价值，结果显示其敏感性、特异性分别是53.80％和87.50％，37.50％和88.70％，AUC分别是0.760和0.694。
　　结论：
　　1.UBE2Q1基因甲基化在HBV-related HCC患者血清中异常表达，联合血清AFP水平可以提高HCC的诊断率，提示血清UBE2Q1基因甲基化可作为检测和诊断HCC的潜在标志物。
　　2.异常的UBE2Q1基因甲基化状态与HBV-related HCC患者的TNM分期呈负相关，提示血清UBE2Q1基因甲基化可用于HCC患者的预后判断。
　　第二部分 外周血单个核细胞UBE2Q1基因甲基化在慢加急性乙型肝炎肝衰竭前期中的研究
　　目的：
　　通过检测Pre-ACHBLF患者，慢性HBV感染患者(Chronic hepatitis B，CHB)及健康志愿者(Health controls，HCs)外周血单个核细胞中UBE2Q1基因甲基化率，分析Pre-ACHBLF患者外周血单个核细胞中UBE2Q1基因甲基化状态与临床指标之间的相关性，随访Pre-ACHBLF患者病情变化并分析ACHBLF发生的各项临床指标，探讨UBE2Q1基因甲基化状态作为ACHBLF早期预警及判断预后的生物学指标的可行性。
　　方法：
　　选取2015年12月至2016年7月在山东大学齐鲁医院肝病科住院的Pre-ACHBLF患者60例，CHB患者40例。HCs 20例作为临床对照。所有Pre-ACHBLF患者随访观察病情变化。采用甲基化特异性PCR法检测各组研究对象外周血单个核细胞中UBE2Q1基因甲基化率，卡方检验及Spearman相关系数分析UBE2Q1基因甲基化状态与pre-ACHLF患者临床指标的相关性。Cox比例风险模型分析早期预警ACHBLF发生的各项临床指标。ROC曲线检测UBE2Q1基因甲基化及联合MELD评分作为早期诊断ACHBLF发生的生物学指标的合理性。
　　结果：
　　1.60例pre-ACHBLF患者，40例CHB患者及20例HCs患者的年龄、性别及血清肌酐水平无统计学差异(P＞0.001);而在表示肝衰竭严重程度的指标ALT、AST、TBIL、ALB、INR及PTA存在显著的统计学差异;Pre-ACHBLF组和CHB组患者HBeAg、HBV-DNA水平无显著差异。
　　2.60例Pre-ACHBLF外周血单个核细胞中UBE2Q1基因的甲基化率为38.33％，明显低于40例CHB组（60.00％，P=0.033）及20例HCs组患者(65.00％，P=0.038)。而CHB组与HCs组UBE2Q1基因的甲基化率无统计学差异（P=0.707）。实时荧光定量PCR检测结果显示，Pre-ACHBLF组中UBE1Q1基因非甲基化的患者UBE2Q1mRNA的表达量(7.85×10-4±0.96×10-4)明显高于UBE1Q1基因甲基化的患者(3.64×10-4±0.55×10-4,P＜0.001)。
　　3.Pre-ACHBLF患者甲基化组与非甲基化组在年龄、性别、HBeAg、HBV-DNA病毒载量、ALT、AST、ALB、肌酐等临床指标间均无显著差异（P＞0.001），但是在反映肝衰竭严重程度的指标TBIL、INR、PTA及MELD评分中，非甲基化组患者的TBIL、INR及MELD评分值明显高于甲基化组，PTA指标明显低于甲基化组，非甲基化组与甲基化组比较差异具有明显统计学意义（P＜0.001）。Spearman相关分析提示，UBE2Q1基因甲基化状态与Pre-ACHBLF患者的TBIL、INR呈明显正相关（rs=0.545，0.505，P＜0.001），而与患者的PTA水平呈明显负相关（rs=-0.441，P＜0.001）。多因素Logistic回归分析结果显示Pre-ACHBLF患者各临床指标均不是UBE2Q1基因甲基化状态的独立影响因素。
　　4.COX回归单因素分析提示TBIL(P=0.001)，PTA (P=0.036)，INR(p=0.002)，MELD评分(P＜0.001)及UBE2Q1基因的低甲基化状态(P＜0.001)均为Pre-ACHBLF进展至ACHBLF患者早期预警因素。上述指标纳入多因素分析，结果显示，MELD评分(P=0.010)及UBE2Q1基因的低甲基化状态(P =0.004)是Pre-ACHBLF进展至ACHBLF患者早期预警因素。ROC曲线分析显示，UBE2Q1基因的甲基化状态早期诊断ACHBLF发生的敏感性92.90％，特异性65.60％，ROC曲线下面积(Area under ROC curve，AUC) 0.792，95％CI 0.675-0.910; MELD评分早期诊断ACHBLF发生的敏感性96.40％，特异性62.50％，AUC 0.831，95％CI0.729-0.934。同时，ROC曲线给出的MELD评分诊断分界点是19.90。UBE2Q1基因的甲基化状态联合MELD评分早期诊断ACHBLF发生的敏感性92.90％，特异性75.00％, AUC 0.895,95％CI 0.818-0.973。
　　结论：
　　UBE2Q1基因低甲基化状态与Pre-ACHBLF患者的疾病严重程度相关，是判断ACHBLF发生的早期预警指标。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 血清UBE2Q1基因甲基化在肝细胞癌诊断中的临床价值

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

第二部分 外周血单个核细胞UBE2Q1基因甲基化在慢加急性乙型肝炎肝衰竭前期中的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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