生物合成假说驱动的新颖安莎和杂合萜类化合物的发现

摘要

本论文系统地对两株具有产生安莎抗生素潜力的链霉菌Streptomyces sp.LZ35和S010的突变株进行了发酵产物的分离、纯化和结构鉴定的研究。该研究采用一系列常规的、实验室通用的分离纯化技术，对代谢产物进行分析分离，共纯化鉴定88个化合物，并应用UV、MS、NMR和X-单晶衍射技术确定了它们的结构，其中新化合物54个，同时对部分化合物的生物活性也进行了研究。
　　对突变株SR201nam1OE的燕麦琼脂培养基的100L平板发酵产物进行分离和结构鉴定，共得到28个化合物(1-28)，包括6个新型8酮萘安莎类化合物neoansamycins D-I(10-15)、4个大环内酯类化合物meridamycins A-D(2-5)和2个二萜cyclooctatin系列化合物（7和8）。化合物10-15的分离鉴定进一步证明nas基因簇是新型8酮萘安莎的生物合成基因簇，为下一步研究该类化合物具体的生物合成途径奠定基础。
　　为研究新骨架杂合萜quinolinecarboxamides类化合物单萜环化部分的形成过程并获得中间体进行体外酶活实验，本课题组时鹏博士研究生在突变株LZ35ΔgdmAIΔnigAΔelpAΔhgcAΔgalΔazaΔcuvΔechA(以下简称LZ35Δ8)的基础上，分别对O-甲基转移酶、G-甲基转移酶和P450单加氧酶基因敲除，获得3株突变株SP302、SP304和SP305。从这3株突变株的燕麦琼脂培养基平板发酵产物中共得到23个化合物(29-51)，其中新化合物18个(29-33、36-45和49-51)，包括15个新型骨架杂合萜quinolinecarboxamides类化合物29-33、36-42和49-51。
　　对链霉菌S010进行培养基优化，最终采用M5琼脂培养基进行平板发酵，从其30L发酵产物中共得到10个化合物(52-61)，其中新化合物3个，遗憾的是未得到目标安莎类化合物。由于本课题组对LZ35菌株的遗传特征研究较为透彻，时鹏博士研究生将S010菌株的五酮安莎基因簇在突变株LZ35Δ8中进行异源表达，得到了突变株SP301。从该突变株的燕麦琼脂培养基的30L平板发酵产物中共得到14个化合物(62-75)，包括10个新化合物，但仍未得到目标安莎类化合物。接着时鹏博士研究生对其五酮安莎基因簇的PKS基因簇上游(Adomain)的启动子进行置换得到突变株SP101，从该突变株的20LYMG琼脂培养基平板发酵产物中共得到13个化合物(76-88)，包括5个新型五酮安莎化合物tetrapetalones E-I(76-80)。化合物76-80的分离鉴定进一步证明tpt基因簇是菌株S010中五酮安莎tetrapetalones类化合物的生物合成基因簇，为下一步研究该类化合物具体的生物合成途径奠定基础。

目录

声明

摘要

缩写说明

第一章 绪论

1．1．1．天然产物的重要性及其传统来源

1．1．2．自然界中放线菌的研究概况

1．2．新型天然产物的挖掘技术

1．2．2．基因组挖掘技术

1．2．3．异源表达和合成生物学技术

1．2．4．代谢工程和组合生物合成技术

1．3．安莎类化合物(ansamycins)的研究概况

1．3．1．安莎类化合物的重要分类

1．3．2．安莎类化合物的生理活性

1．4．来源于放线菌的杂合萜类化合物

1．4．1 杂合萜类化合物的研究概况

1．4．2．杂合萜类化合物的分类

1．4．3．杂合萜类化合物的生物活性

1．5．美利霉素类化合物

2．1 实验材料

2．1．1 常用培养基及所用溶液

2．1．2．常用仪器

2．1．3．常用试剂与耗材

2．1．4．常用显色剂

2．1．5．抗菌实验指示菌株

2．2．实验方法

2．2．2．薄层色谱(Thin-layer chromatography，TLC)

2．2．4．正相硅胶柱层析(Si gel)

2．2．5．重结晶实验(Recrystallization)

2．2．7．旋光测定(Polarimeter)

2．2．8．质谱测定(MS)

2．2．10．生物活性测定

第三章 链霉菌LZ35四株突变株的次级代谢产物的研究

3．1 前言

3．2．突变株SR201nam1OE 100 L发酵产物的研究

3．2．1．菌株介绍

3．2．2．突变株SR201nam1OE的培养及发酵产物的分离纯化

3．2．3．对甲醇(MeOH)相提取物进行分离纯化

3．2．4．实验结果与分析

3．2．5．分离自突变株SR201nam1OE的部分化合物的生物活性研究

3．2．6．讨论

3．3．突变株SP302(LZ35Δ8ΔMT)45 L发酵产物的研究

3．3．1．菌株介绍

3．3．2．突变株SP302的培养及发酵产物的分离纯化

3．3．3．对甲醇(MeOH)相提取物进行分离纯化

3．3．4．实验结果与分析

3．3．5．分离自突变株SP302的杂合萜类化合物29-33的生物活性研究

3．3．6．讨论

3．4．突变株SP304 50 L发酵产物的研究

3．4．1．菌株介绍

3．4．2．突变株SP304的培养及发酵产物的分离纯化

3．4．3．对甲醇(MeOH)相提取物进行分离纯化

3．4．4．实验结果与分析

3．4．5．分离自突变株SP304的杂合萜类化合物36-42的生物活性研究

3．4．6．讨论

3．5．突变株SP305 50 L发酵产物的研究

3．5．1．菌株介绍

3．5．2．突变株SP305的培养及发酵产物的分离纯化

3．5．3．对甲醇(MeOH)相提取物进行分离纯化

3．5．4．实验结果与分析

3．5．5．分离自突变株SP305的杂合萜类化合物49-51的生物活性研究

3．5．6．讨论

第四章 土壤链霉菌Streptomyces sp．S010次级代谢产物的研究

4．1．前言

4．2．2．对甲醇(MeOH)相提取物的分离纯化

4．2．3．实验结果与分析

4．2．4．讨论

4．3．3．对甲醇(MeOH)相提取物进行分离纯化

4．3．4．实验结果与分析

4．3．5．讨论

4．4．2．突变株SP101的培养及发酵产物的分离纯化

4．4．3．对甲醇(MeOH)相提取物进行分离纯化

4．4．4．实验结果与分析

4．4．5．分离自突变株SP101的Tetropetalones系列化合物76-80的生物活性研究

4．4．6．讨论

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

研究生期间的学术成果

附录