神经根炎大鼠自噬和凋亡及医用臭氧的干预作用研究

摘要

疼痛，作为第五大生命体征，越来越引起临床关注。而有效缓解或根除患者的疼痛自然成为一个关键。腰腿痛是目前最广泛的病症之一，多与椎间盘突出相关，有许多研究学者已经发现，神经根炎(Radiculitis)是导致顽固的根性疼痛祸首之一。研究和探讨神经根炎的致病机理和臭氧治疗的内在机制能为临床诊治提供新的理论依据以及潜在的作用靶点。 大量研究表明，自噬与凋亡通路之间存在着错综复杂的对话(Cross-talk)，两者有共同的刺激因子和调节蛋白。目前认为，凋亡和自噬在介导细胞死亡过程中，存在着如下几种可能的关系:凋亡和自噬协同促进细胞死亡，二者可能同时或先后被活化，协同调控细胞死亡;凋亡和自噬互为拮抗，自噬通过加速受损细胞器或蛋白聚集物的清除，使大分子物质得以循环利用，保护细胞免于凋亡;自噬促进凋亡相关特征的显现，但自噬并不作为诱发细胞死亡的直接原因。众多调控元件参与凋亡和自噬的交互应答机制，包括Beclin1、Bcl-2家族蛋白p53等。在神经根炎发生发展过程中是否存在神经细胞凋亡和自噬尚不清楚。 臭氧是一种无色、有刺激性气味的气体，具有不稳定、难以储存、强氧化性、常温常压状态下大约四五十分钟就会转化成氧气等特点。臭氧的使用是一把“双刃剑”，当高浓度或大剂量使用的时候，臭氧对于生物体有着严重的副作用，然而小剂量的较低浓度的臭氧却可以有效的提高血液抗氧化能力。众所周知，医用臭氧具有“杀菌、抗病毒、消炎、镇痛及免疫调节”等多种生物功能，在临床上已经用于腰间盘突出、疼痛、创伤及难治性溃疡、中风和病毒性肝炎等疾病的治疗，而且均有良好的效果。 截至目前，关于臭氧疗法的作用机制包括较低浓度的臭氧可以使髓核脱水、缩小，从而一定程度上缓解椎间盘的压迫;医用臭氧可以刺激抗炎因子IL-10和成纤维生长因子-β1(TGF-β1)的释放，可以抑制凋亡蛋白和IL-1β的过度表达，能较好地改善局部氧供，从而减轻炎性反应。但基于自噬和凋亡理论来探讨关于低浓度臭氧治疗神经根炎的内在机制，鲜有研究。 鉴于此，本论文拟通过建立大鼠神经根炎模型，观察神经根炎大鼠脊髓组织自噬及凋亡的表达特征，观察低浓度医用臭氧对根神经炎的治疗作用，并且从自噬结合凋亡的角度初步探讨臭氧治疗根神经炎的可能机制。 第一部分 神经根炎大鼠脊髓组织的自噬和凋亡 方法: 选取健康清洁级250-300g的Wistar大鼠36只，雌雄不限，随机分为二组，每组18只:模型组(Model group)和假手术组(Sham group)。模型组为弗氏佐剂致神经根炎组，将包含50ul完全性弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant)CFA的止血氧化纤维素放在L5背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)上，致根性神经炎。假手术组椎板切除后，暴露L4/5右侧椎间孔及L5背根神经节，放置包含50ul生理盐水的止血氧化纤维素。在造模成功后8h、24h、72h各组分别取3只大鼠，取脊髓，保留L5背根神经节，行电镜观察、免疫荧光双标检测LC3Ⅱ/NeuN表达、免疫组化检测Caspase3表达、RT-PCR法测定组织中Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65mRNA水平、Western blotting测定组织中Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65的蛋白水平，统计分析各组差异的显著性。 结果: 1.透射电镜观察:通过采用电子显微镜观察胞质中的自噬体来研究神经根炎症大鼠模型中脊髓组织的自噬情况。结果表明，手术造模后，在8h、1天和3天脊髓组织细胞质中发现一些自噬体，其包含异常结构高电子密度物质(如双膜)和许多细胞器。 2.免疫荧光双标检测LC3Ⅱ/NeuN表达:模型组大鼠脊髓组织细胞质出现很多LC3B染色区域。假手术组大鼠脊髓组织细胞质几乎没有LC3B染色区域，假手术组大鼠神经根细胞质NeuN染色区域很少。 3.免疫组化检测Caspase3表达:与假手术组相比，模型组大鼠神经根细胞8h、24h、72h时出现较多裂解caspase3阳性染色细胞。 4.RT-PCR法测定组织中Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65mRNA水平首先采用标准试剂及方法对定量荧光PCR检测系统进行了校验，结果显示，实验系统与理论值的相关系数达到0.9978，接近1，表明该实验系统可以用来准确地检测基因的mRNA水平。采用该检测系统检测LC3B、Beclin1、PDE2A、NF-κBp65mRNA水平，结果显示:与假手术组相比，模型组8h、24h、72h的Beclin1、LC3B mRNA水平显著升高。与假手术组相比，模型组72h的PDE2A和NF-κBmRNA水平明显升高。 5.Western blotting测定组织中Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65的表达。与假手术组比，模型组8h、24h、72h的Beclin1、LC3B蛋白水平显著升高。与假手术组比，模型组72h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平显著升高。 结论: 本研究成功建立了化学性神经根炎大鼠模型，其脊髓组织中出现自噬特征性结构，自噬生物标志物(LC3B和Beclin1)表达水平升高，凋亡关键指标裂解Caspase3在脊髓和神经根细胞中的表达升高，凋亡相关指标PDE2A和NF-κBp65的表达水平也升高。因此，化学性神经根炎大鼠脊髓组织及神经细胞出现自噬和凋亡增强现象。 第二部分 医用臭氧对神经根炎大鼠脊髓组织的自噬和凋亡的影响 方法: 选取健康清洁级250-300g的Wistar大鼠54只，雌雄不限，随机分为三组，每组18只: A组为模型组(n=18)，即弗氏佐剂致神经根炎组(将浸含50ul完全性弗氏佐剂CFA的止血氧化纤维素放在L5背根神经节处)。 B组为臭氧治疗组(n=18)，建模成功后，硬膜外注入30μg/ml臭氧50μl。 C组为对照组(n=18)。即在L5背根神经节处，放置浸含50ul生理盐水的止血氧化纤维素。建模成功后，模型组和对照组分别给予过滤空气50μl，连续3天。在给药后8h、24h、72h各组分别取3只大鼠，取脊髓，保留L5背根神经节，行透射电镜观察、免疫荧光双标检测LC3Ⅱ/NeuN表达、免疫组化检测Caspase3表达、RT-PCR法测定组织中Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65mRNA表达水平、Western blotting测定组织中Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κBp65的蛋白水平。 结果: 1.透射电镜观察:手术造模后，模型组在8h、1天和3天脊髓组织中发现一些自噬体，其包含异常结构(如双膜)和许多细胞器。与模型组比较，臭氧治疗组自噬体的数量明显减少。 2.免疫荧光双标检测LC3Ⅱ/NeuN表达:模型组大鼠脊髓组织出现很多LC3B染色区域。与模型组比较，臭氧治疗组LC3B染色区域面积明显降低。而对照组几乎没有LC3B染色区域。同样，模型组大鼠脊髓组织出现很多NeuN染色区域。与模型组比较，臭氧治疗组NeuN染色区域面积降低。对照组NeuN染色区域很少。 3.免疫组化检测Caspase3表达:模型组大鼠脊髓组织8h、24h、72h时出现很多裂解caspase3阳性染色细胞。与模型组比较，臭氧治疗组裂解caspase3阳性染色细胞数明显降低，几乎达到对照组大鼠的水平。 4.RT-PCR法测定组织中Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65mRNA水平:结果显示:与对照组比，模型组8h、24h、72h的Beclin1和LC3B mRNA水平显著升高。与模型组比，臭氧治疗组8h、24h、72h的Beclin1和LC3B mRNA水平均明显降低，然而仍明显比对照组的高。与对照组相比，模型组72h的PDE2A和NF-κB p65mRNA水平显著升高。与模型组相比，臭氧治疗组72h的PDE2A和NF-κB p65mRNA水平均明显降低，然而仍明显比对照组的高。 5.Western blotting测定组织中Beclin1、LC3B、PDE2A、NF-κB p65的表达:Beclin1蛋白水平:与对照组比，模型组8h、24h、72h的Beclin1和LC3B蛋白水平显著升高。与模型组比，臭氧治疗组8h、24h、72h的Beclin1和LC3B蛋白水平均明显降低，然而仍明显比对照组的高。与对照组比，模型组72h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平显著升高。与模型组比，臭氧治疗组72h的PDE2A和NF-κB p65蛋白水平均明显降低，然而仍明显比对照组的高。 结沦: 本研究成功建立了化学性神经根炎大鼠模型。治疗浓度30μg/ml的医用臭氧治疗能显著抑制炎症大鼠自噬体的出现及自噬生物标志物(LC3B和Beclin1)和凋亡关键指标裂解Caspase3在脊髓组织中的表达。同时，臭氧抑制神经根炎大鼠模型中PDE2A和NF-κB p65的过表达。因此，治疗浓度30μg/ml的臭氧可抑制自噬，减少细胞凋亡，从而用于治疗神经根炎。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分神经根炎大鼠脊髓组织的自噬和凋亡

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

第二部分医用臭氧影响神经根炎大鼠脊髓组织的自噬和凋亡

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

全文结论

参考文献

综述

致谢

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