人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素复合基因的克隆和表达

摘要

抗体技术经历血清多克隆抗体、单克隆抗体阶段后发展到了第三代抗体-基因工程抗体。我们在前期研究中通过噬菌体抗体库筛选到人源抗HBsAg基因工程抗体,利用PCR定点突变获得二硫键稳定的dsFv(disufide—stabilized Fv fragments)抗体,但抗体的轻链与干扰素α的融合基因和重链基因分别克隆于pCI—neo和pCdhfrl两个质粒中,需要共转染细胞才能获得表达。本研究拟在此基础上进一步探索改进,整体思路是将人源抗HBsAgdsFv抗体的轻链-干扰素α融合基因和重链基因通过自身切割肽F2A连接置于同一开放读码框,实现抗体的轻链和重链在同一质粒中的串联表达。
　　 首先在过渡载体pCI—GPI中构建抗体靶向干扰素复合基因:即通过重叠延伸PCR法将dsFv抗体重链基因Ⅷ的3’端融入一段带正电荷的DNA负载区基因,使目的蛋白带正电荷,以结合带负电的质粒DNA；并在抗体轻链-干扰素α融合基因3’端连入6×His标签,以方便表达蛋白的检测和纯化。通过自身切割肽F2A将人源抗HBsAg dsFv抗体的轻链复合基因和重链复合基因连接置于同一开放读码框,并在过渡载体pCI—GPI中实现轻、重链复合基因的连接即得到重组质粒pCIGPI—dsFva pr+。
　　 其次,选择哺乳动物表达系统和昆虫细胞／杆状病毒表达系统分别表达抗体靶向干扰素重组复合基因。即在构建好pCIGPI—dsFva pr+的基础上,把抗体靶向干扰素复合基因通过酶切和PCR等方法克隆入真核表达载体pEE14.1及杆状病毒表达系统转移载体pAcGP67A,从而获得含抗体靶向干扰素复合基因的重组表达质粒pEE14.1-dsFva pr+和pAcGP67A—dsFva pr+,并分别在哺乳动物细胞CHO-K1和昆虫细胞Sf9中验证其表达。此外,我们还把哺乳动物表达系统和昆虫细胞／杆状病毒表达系统表达的上清中的目的蛋白分别进行了纯化,并对其进行了初步验证。
　　 总之,含抗体靶向干扰素重组基因的重组质粒的构建及其在哺乳动物表达系统和昆虫细胞／杆状病毒表达系统中表达的尝试,为后续抗体靶向干扰素蛋白结合HBV治疗性DNA疫苗的抗乙肝靶向纳米粒药物的研制奠定了基础,也为HBV的免疫基因治疗提供了新的技术策略。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 乙型肝炎病毒(HBV)简介

1.1 HBV及其基因组的结构

1.2 HBV的复制过程

1.3 HBV的致病机理

2 慢性乙型肝炎治疗现状与进展

3 立题依据与研究思路

3.1 立题依据

3.2 研究思路

第二章 人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素复合基因的设计与克隆

1 材料与仪器

1.1 引物、菌株和质粒、细胞株

1.2 酶和试剂

1.3 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素复合基因的总体设计

2.2 人源抗HBsAg dsFv抗体重链复合基因的设计与合成

2.3 人源抗HBsAg dsFv抗体轻链复合基因的设计与合成

2.4 过渡载体pCI-GPI中人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素复合基因的克隆

3 实验结果

3.1 人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素复合基因的总体设计

3.2 人源抗HBsAg dsFv抗体重链复合基因的合成

3.3 人源抗HBsAg dsFv抗体轻链复合基因的合成

3.4 过渡载体pCI-GPI中人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素复合基因的克隆

4 讨论

第三章 抗体靶向干扰素复合基因在哺乳动物细胞系统中的表达

1 材料与仪器

1.1 菌株和质粒、细胞株

1.2 酶和试剂

1.3 主要溶液的配制

1.4 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 重组质粒pEE14.1-dsFv α pr+的构建

2.2 重组质粒pEE14.1-dsFv α pr+瞬时转染哺乳动物细胞CHO-K1并验证其表达

2.3 纯化上清中的目的蛋白及验证

3 实验结果

3.1 重组质粒pEE14.1-dsFv α pr+的构建

3.2 重组质粒pEE14.1-dsFv α pr+瞬时转染哺乳动物细胞CHO-K1并验证其表达

3.3 纯化上清中的目的蛋白及验证

4 讨论

第四章 抗体靶向干扰素复合基因在昆虫细胞/杆状病毒系统中的表达

1 材料与仪器

1.1 引物、菌株和细胞株

1.2 酶和试剂

1.3 主要溶液的配制

1.4 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 重组质粒pAcGP67A-dsFv α pr+的构建

2.2 重组质粒pAcGP67A-dsFv α pr+转染昆虫细胞Sf9并验证其表达

2.3 纯化上清中的目的蛋白及验证

3 实验结果

3.1 重组质粒pAcGp67A-dsFv α pr+韵构建

3.2 重组质粒pAcGP67A-dsFv α pr+转染昆虫细胞Sf9并验证其表达

3.3 纯化上清中的目的蛋白及验证

4 讨论

第五章 结论与展望

附录 :缩略语索引

参考文献

在校期间的研究成果及发表的学术论文

致谢