传染性法氏囊病病毒VP2基因在酵母细胞内的表达及发酵工艺的最优化

摘要

传染性法氏囊病(IBD)是世界范围内尚未攻克的难题之一，该病能够引起鸡体的法氏囊组织发生萎缩，严重甚至出血，还导致鸡体免疫抑制，一旦感染次病，就会出现大规模的鸡群死亡。由于引起该病的传染性法氏囊病毒(IBDV)经常发生变异，很难控制该病的传播，因此，世界各国科研人员纷纷就此病展开了研究。
　　本实验包括两个部分，一部分是将IBDV的VP2基因转入毕赤酵母细胞内并进行表达，另一部分确定最佳的发酵工艺。
　　(1)利用RT-PCR技术将VP2蛋白的cDNA序列转为VP2蛋白表达基因。
　　(2)将VP2基因连接到克隆质粒PMD18-T上，构成克隆载体PMD18-VP2。
　　(3)以PMD18-VP2为模版，用Premier5.0设计引物，将VP2基因转入表达质粒Ppicza上，构建表达载体Ppicza-VP2。
　　(4)将表达载体Ppicza-VP2转入毕赤酵母细胞内。
　　(5)，通过序列分析和酶切电泳确定VP2基因成功转入克隆载体、表达载体和酵母细胞内。电泳图显示VP2基因长度为1.5kb，与理论相符。
　　(6)单因素实验确定影响诱导VP2蛋白表达的四个因素水平，确定最佳反应温度为28℃，最佳pH为4.0，最佳反应转速为190r/min，最佳诱导剂一甲醇添加量为3％。
　　(7)L9(33)正交试验确定诱导蛋白表达的主导因素为诱导剂-甲醇的添加量，并确定最佳的因素配比即A2B3C2。
　　(8)用紫外分光光度计法测定VP2蛋白表达量为0.6554g/L，属于高效表达。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 传染性法式囊病(Infectious bursal disease，IBD)概述

1.2 传染性法氏囊病病毒的介绍

1.2.1 传染性法氏囊病病毒的概述

1.2.2 IBDV基因组结构

1.2.3 基因组编码蛋白的功能

1.3 IBDV的变异和毒力

1.4 基因工程疫苗的研究进展

1.4.1 大肠杆菌系统表达

1.4.2 酵母系统表达

1.4.3 杆状病毒系统表达

1.4.4 构建活载体疫苗

1.4.5 IBDV核酸疫苗的研究进展

1.5 免疫防治的策略

1.6 免疫失败的原因

1.7 我国目前IBDV的研究现状

1.8 本论文的目的和意义

第二章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验仪器

2.1.2 IBDV毒株、克隆载体、表达载体及宿主细胞

2.1.3 实验试剂和所用的酶

2.2 实验方法

2.2.1 利用RT-PCR技术提取VP2序列

2.2.2 将RT-PCR产物与PMD18-T相连

2.2.3 把克隆质粒中的VP2基因转入到表达载体Ppicza中

2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.5 将重组的表达质粒Ppicza-VP2转入大肠杆菌感受态细胞中

2.2.6 重组的表达质粒Ppicza-VP2转入大肠杆菌中的电泳确定

2.2.7 重组表达质粒Ppieza-VP2的序列鉴定

2.2.8 毕赤酵母感受态细胞的制备

2.2.9 把重组表达载体Ppicza-VP2转染到毕赤酵母感受态细染色体DNA中

2.2.10 转染后酵母的扩大培养

2.2.11 用聚合酶链式反应确定转染是否成功

2.2.12 转染酵母细胞的VP2蛋白的诱导表达条件的最优化

2.2.13 从酵母细胞中提取VP2蛋白

2.2.14 用紫外分光光度计法测定VP2蛋白的含量

第三章 实验结果

3.1 克隆载体PMD18-VP2序列测定结果

3.2 将Ppicza-VP2表达载体转入大肠杆菌的结果确定

3.2.1 经限制性内切酶EcoRI酶切电泳图

3.2.2 经限制性内切酶XbaI+XSacI酶切的电泳图

3.2.3 从大肠杆菌中提取Ppicza-VP2表达载体的序列分析

3.3 表达载体Ppicza-VP2转入毕赤酵母感受态细胞染色体DNA中的酶切确定

3.4 反应温度对诱导表达VP2蛋白的影响结果

3.5 反应转速对诱导VP2蛋白表达含量的影响

3.6 pH对诱导表达VP2蛋白量的影响结果

3.7 诱导剂甲醇添加量对诱导VP2蛋白表达量的影响结果

3.8 正交实验确定最佳的反应温度、反应转速和诱导剂添加量

第四章 分析与讨论

4.1 真核系统对IBD VP2蛋白表达的优势

4.2 表达载体Ppicza的优势

4.3 最佳反应条件的确定

4.4 本实验存在的缺点

第五章 实验结论

5.1 分子微观方面的成果

5.2 用毕赤酵母表达系统表达IBDV VP2蛋白中试成果

5.3 酵母表达量为有效表达

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文