北极斯瓦尔巴群岛冰川流域氮循环细菌的多样性及分类学研究

摘要

目前，开展对南、北极等极端环境微生物资源的研究已成全球热点。北极斯瓦尔巴德群岛是北极地区最大的冰川聚集区，是整个北极地区的典型地貌，也是国际上冰川物质平衡监测研究的重点区域之一。本研究从这种北极极具代表性的冰川流域（北纬78°53′～79°32′，东经11°43'～12°43'，包括冰川上、中、下游）采集土壤和冰水共5份，采用普通和专用培养基对其中的可培养一般性细菌和氮循环细菌进行富集、分离，从中分离得到普通细菌分离菌63株、固氮菌48株、反硝化菌42株、硝化细菌63株、亚硝化细菌56株;进而采用16S rDNA序列测定的方法对各分离菌进行系统发育多样性研究，并采用PCR扩增的方法对氮循环分离菌的nifH、narG、norB、amoA等功能基因进行检测。另外，对研究中所发现的个别疑似新菌种，采用形态、生理生化、遗传等表型、遗传特征鉴定的方法对其进行详细的多相分类定位。本研究的目的旨在通过对该特殊生态区氮循环细菌多样性的初步研究，为下一步即将全面展开的北极其它环境氮循环微生物的多样性及其生态学研究提供参考。
　　多样性研究结果表明:(1)5个采集样品中的各分离细菌计数以BT（冰川流域鸟类活动区）样品含量最高，MS最低（冰川融水）;但其中反硝化细菌计数是以AT(冰川下土壤)和TN(冰川苔藓底泥)样品含菌量最低。(2)菌落颜色实验显示，固氮分离菌的菌落颜色较为单一，而硝化菌、反硝化菌、亚硝化菌则表现出菌落颜色的多样性。(3)从5个样品中分离的一般性可培养细菌(LB培养基分离)共分布于7纲18属，表现出极大的16S rDNA系统发育多样性，其中优势菌主要集中在Gammaproteobacteria纲的Pseudomonas属(31.3％);另外还从中发现了11株疑似潜在新种。(4)固氮分离菌（无氮培养基分离）的系统发育多样性极为单一，其中分布在Gammaproteobacteria纲Pseudomonas属的菌株占绝对优势(93.9％)。(5)反硝化分离菌（反硝化细菌分离培养基）的系统发育多样性也不是太丰富，主要集中在Gammaproteobacteria纲和Actinobacteria_c纲的5属内，其中57.8％的反硝化分离菌集中在Gammaproteobacteria纲Pseudomonas属，为优势菌。(6)硝化分离菌（硝化细菌培养基分离）表现出一定程度的系统发育多样性，主要分布在Actinobacteria_c纲的2属、Alphaproteobacteria纲的3属、Gammaproteobacteria纲的2属、Betaproteobacteria纲的1属、Bacilli纲的1属之中。其中Actinobacteria c纲的Rhodococcus属(32.4％)和Arthrobacter属(21.6％)为优势菌。(7)亚硝化分离菌（亚硝化细菌培养基分离）表现出比较高的系统发育多样性，主要分布在Alphaproteobacteria纲的2属、Gammaproteobacteria纲的2属、Bacilli纲的1属、Actinobacteria_c纲的3属，其中优势菌集中在Gammaproteobacteria纲的Pseudomonas属(37.9％)。
　　对从北极斯瓦尔巴德岛冰川下游海水中分离的疑似新种S1-10菌株的多相分类结果表明:S1-10菌株与其关系最近标准模式菌株Aequorivita viscose8-1bT的最高16S rDNA序列相似性为97.60％，两者DNA-DNA杂交同源率为33％，S1-10菌株的G+C％含量为33.59％（在Aequorivita属范围内）。另外，在碳源氮源利用、抗生素抗性、耐碱性、酶及水解反应等特征上，S1-10菌株与标准菌株Aequorivitaviscose8-1bT也有一些差异。由此判定S1-10菌株是Aequorivita属内的一个新种，暂定名为Aequorivita beijibingchuans S1-10T。
　　本研究是首次对北极地区氮循环微生物的多样性研究，其结果不仅能为进一步全面研究北极地区氮循环微生物的多样性及其生态功能提供参考，而且也丰富了我国极端环境生态功能菌的种质资源库和现有国际极端环境氮循环细菌的分类系统。

目录

摘要

前言

第一章 文献综述

1．1 极地微生物研究现状

1．1．1 国外研究

1．1．2 国内研究

1．1．3 极地微生物资源面临的问题及展望

1．2 极端环境氮循环微生物的研究进展

1．2．1 深海沉积物中氮循环微生物的研究进展

1．2．2 青藏高原氯循环微生物的研究进展

1．3 极地氮循环研究的意义

1．3．1 极地对全球气候的影响

1．3．2 极地氮循环对全球气候的影响

1．4 极地氮循环微生物的研究进展

1．4．1 固氮作用及研究现状

1．4．2 反硝化作用及研究现状

1．4．3 硝化作用及研究现状

1．5 研究展望及本研究的目的和意义

第二章 北极冰川氮循环细菌的多样性研究

2．1 实验材料

2．1．1 样品的采集

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．1．4 培养基配方

2．2 实验方法

2．2．1 样品处理、总菌计数、及菌株富集与分离

2．2．2 菌体观察及拍照

2．2．3 Griess反应

2．2．4 分离菌株的总DNA的提取

2．2．5 16S rDNA的PCR扩增、产物回收、测序及系统发育树的构建

2．2．6 分离菌功能基因的PCR扩增检测

2．3 结果与讨论

2．3．1 样品含菌量计数结果

2．3．2 菌株的形态学观察

2．3．3 Griess反应结果

2．3．4 细菌总DNA的提取、16S rDNA-PCR扩增及产物的纯化结果

2．3．5 16S rDNA序列测定结果与系统发育学分析

2．4 本章总结

第三章 疑似新种S1-10菌株的多相分类鉴定

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．2．3 培养基配方

3．3 实验方法

3．3．1 菌株表型性状的测定

3．3．2 代时测定

3．3．2 耐盐性测定

3．3．4 pH生长范围的测定

3．3．5 生长温度范围的测定

3．3．6 运动性测定

3．3．7 唯一碳源利用

3．3．8 唯一氮源利用

3．3．9 抗生素敏感度测定

3．3．10 生化及水解反应

3．3．11 细菌总DNA大量提取

3．3．12 G+C％含量测定

3．3．13 DNA—DNA杂交同源性测定

3．4 结果与讨论

3．4．1 S1-10菌株的形态特征及代时

3．4．2 生理特征

3．4．3 生化特征及水解反应

3．4．4 遗传特征

3．5 本章总结

本文创新点

参考文献

附录

致谢

硕士期间发表的论文

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