肌醇六磷酸诱导人结肠癌细胞系HT-29凋亡及Ca、凋亡相关基因与蛋白的表达

摘要

目的：用不同浓度的肌醇六磷酸(Inositol Hexaphosphate，IP6)以不同时间作用于人结肠癌细胞系HT-29，观察IP6对癌细胞凋亡的影响并对其作用机制进行探讨。 方法： 1将不同浓度的耽(0mM、1.8mM、3.3mM、5.0mM、8.0mM、13.0mM)作用于HT-29细胞一定时间(0～6d)，通过MTT法观IP6对HT-29细胞的增殖抑制作用； 2将不同浓度IP6(0mM、1.8mM、3.3mM)以不同时间(3d、3m、6m)作用于HT-29细胞。用透射电镜观察IP6对HT-29细胞凋亡的作用；流式细胞仪检测IP6对HT-29细胞作用前后的细胞凋亡率的变化；Fura-2/AM法测定IP6作用前后细胞内Ca2+浓度的变化；RT-PCR检测法检测细胞内Caspase-3mRNA的表达；应用免疫细胞化学方法分别检测凋亡相关基因Bcl-2、NF-κ B的表达。 结果： 1.MTT实验结果显示，IP6持续作用能够有效抑制HT-29细胞的增殖，并且具有剂量和时间依赖关系。 2透射电镜结果表明，经IP6作用的HT-29细胞发生染色体固缩，电子密度增高，细胞浆浓缩，细胞膜保存完整，可见凋亡小体。 3流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，各IP6作用组HT-29细胞凋亡率均升高(P<0.05)，并且细胞凋亡率随着IP6作用时间的延长而升高(P<0.05)；其中IP6作用6m时间组的细胞凋亡率与对照组相比有高度统计学意义(P<0.01)。 4细胞内Ca2+浓度检测结果显示，IP6各实验组与对照组相比细胞内Ca2+浓度均升高(P<0.05)，并且随着IP6作用时间的延长，细胞Ca2+浓度升高更明显(P<0.05)。 5 RT-PCR结果表明，与对照组相比，IP6各实验组的Caspase-3mRNA表达显著性增高；随着作用时间的延长，Caspase-3mRNA表达有升高的趋势；其中与其他时间组相比，IP6作用6 m时间组Caspase-3mRNA的表达显著性升高(P<0.01)。 6免疫细胞化学实验结果表明，不同浓度的IP6可以抑制HT-29细胞的Bcl-2蛋白表达，并且随着作用时间的延长，Bcl-2蛋白的表达随之降低(各IP6作用时间组之间相比均为P<0.05)；不同浓度的IP6均可抑制细胞核转录因子NF-κ B的表达(P<0.05)，随作用时间的延长，NF-κB蛋白的表达有降低的趋势；与其他IP6作用时间组相比， IP6作用6 m时间组NF-κB表达降低有统计学意义(JP<0.05)。 结论： 1.IP6对HT-29细胞的增殖具有明显的抑制作用，并且这种抑制作用具有浓度依赖关系(在IP6作用浓度为0-13.0mM范围内)和时间依赖关系(在IP6作用时间为0～6d范围内)。 2.IP6具有促进HT-29细胞凋亡的作用。IP6诱导HT-29细胞的凋亡可能是通过调控细胞信号转导，调节相关凋亡基因的表达来实现的。IP6及其次级磷酸化形式可以促进HT-29细胞胞内Ca2+浓度的增高，从而引发钙超载介导的细胞凋亡活动，这其中包括激活Caspase家族的非活化酶原，引起Caspase-3的级联放大效应，导致细胞内的一系列蛋白底物的裂解作用，促进凋亡的发生。在此过程中，IP6抑制了抗凋亡基因Bcl-2与核转录因子NF-κB的表达，促进细胞凋亡的发生，发挥抗结肠癌的作用。 3矾促进HT-29细胞凋亡的作用相对缓和，但具有时间效应趋势，提示IP6长期作用可能会更有效的发挥抗结肠癌的功能。

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综述：肌醇六磷酸的抗肿瘤作用研究进展

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