姜黄素对6-OHDA诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用

摘要

帕金森病(parkinson’s disease，PD)是继阿尔茨海默病之后的第二大神经系统退行性疾病。我国目前拥有170万-200万帕金森病患者，65岁以上人群帕金森发病率已高达1.7％。随着我国社会老龄化趋势的不断发展，PD对患者和社会的负担将越来越重。 PD的主要病理学特征是黑质(substantia nigra, SND区多巴胺(Dopamine，DA)能神经元的渐进性死亡及伴发的纹状体(striatum，Str)轴突末梢DA的耗竭。目前PD的发病机制尚不清楚，但可能与遗传因素、环境因素、氧化应激、炎症反应和神经营养因子缺失等多种因素的共同参与有关。到目前为止对PD没有行之有效的治疗办法，在临床上也只能对症治疗。因此，深入探讨PD的发病机制并研制出针对PD病因有效的药物成为医学界迫在眉睫的话题。 天然的黄酮类化合物具有多种生物学活性，已经被人们广泛地应用于神经退行性疾病的防治研究中。姜黄素( curcumin)是一种从姜黄根中提取的植物多酚，在不同的组织中都被证实了其具有极强的清除自由基、螯合金属离子和抗炎的作用。本实验的目的在于进一步探讨姜黄素对PD的防治作用及对DA能神经元保护作用的可能机制。首先制备了(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导的PD大鼠模型，应用高效液相电化学检测(HPLC-ECD)法，观察了6-OHDA处理后，大鼠Str的DA及其代谢产物二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量变化；应用免疫组织化学的方法，观察了大鼠SN区酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目表达的变化；同时运用了铁染色的方法，观察了大鼠SN区铁染色阳性细胞数目表达的变化，又分别运用了以上的技术方法观察了姜黄素对这些改变的影响。在6-OHDA诱导的PD细胞模型，应用甲基噻（）基四（）(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)，观察了细胞的存活率；应用流式仪细胞术(flow cytometry,FCM)，观察了细胞线粒体跨膜电位差（mitochondrial transmembrane potential，ΔΨm）和活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的变化；运用Westem blots的方法，分别观察了超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase，SOD)和核转录因子(nuclear factor-kappaB，NF-KB)蛋白水平的变化，同时运用以上的技术方法观察了姜黄素对这些改变的影响。结果如下： 1.与对照组相比，6-OHDA损伤大鼠后，Str的DA及DOPAC的含量明显降低(P<0.05)，HVA的含量没有明显改变(P>0.05)。而姜黄素预处理组的DA及其代谢产物的含量与6-OHDA组相比，明显升高(P<0.05)。 2.6-OHDA损伤的大鼠SN区，TH免疫阳性细胞数显著减少，与对照组比较有显著性差异(P<0.01)，而经姜黄素预处理后，TH免疫阳性细胞数明显增多，与6-OHDA组比较有统计学意义(P<0.01)。 3.6-OHDA损伤的大鼠SN区，铁染色阳性细胞数较对照组显著增多(P<0.01)，而姜黄素处理后，可以有效地抑制6-OHDA的这一效应。 4.MIT法检测DA能细胞株MES23.5细胞存活率的结果显示：6-OHDA处理MES23.5细胞24h，细胞存活率随6-OHDA浓度增加而逐渐降低。给予25μmol/L和50μmol/L浓度的6-OHDA时，与对照组比较，细胞存活率下降了13％和12％；给予100μmol/L and150μmoyL浓度的6-OHDA时，与对照组比较，细胞存活率分别下降了44％ and65％，差别有统计学意义(P<0.01)。单独用姜黄素处理MES23.5细胞24h，当给予姜黄素的浓度大于15μmol/L时，细胞存活率与对照组相比有显著降低(P<0.01)。 5.MTT法检测DA能细胞株MES23.5细胞存活率的结果显示：经10μmol/L的姜黄素预处理后，6-OHDA损伤的MES23.5细胞的存活率与单纯6-OHDA损伤组相比明显提高，差别有统计学意义(P<0.01)。 6.FCM检测ΔΨm发现，MES23.5细胞经100μmol/L的6-OHDA孵育24 h后，MES23.5细胞的ΔΨm较对照组相比明显降低，经10μmol/L的姜黄素预处理后，可以抑制由6-OHDA造成的细胞ΔΨm的降低，与单纯6-OHDA组相比，差别有统计学意义(P<0.01)。 7.FCM检测ROS发现，MES23.5细胞经100μmol/L的6-OHDA孵育24 h后，MES23.5细胞内ROS的水平较对照组相比明显升高，经10μmol/L的姜黄素预处理后，可以抑制由6-OHDA造成的细胞内ROS水平的升高，与单纯6-OHDA组相比，差别有统计学意义(P<0.01)。 8.100μmol/L6-OHDA处理MES23.5细胞24h后，Cu/Zn-SOD的蛋白表达水平较对照组相比明显降低，经10μmol/L的姜黄素预处理后，Cu/Zn-SOD蛋白表达水平与单纯6-OHDA组相比明显升高，差别有统计学意义(P<0.01)。 9.100μmol/L6-OHDA处理MES23.5细胞24h，位于核内的NF-кB蛋白表达水平明显升高，经10μmol/L的姜黄素预处理后，可以抑制NF-кB由胞浆向核内的移位，与单纯6-OHDA组相比，差别有统计学意义(P<0.01)。 上述结果表明：在体实验中，姜黄素对6-OHDA损伤的大鼠黑质DA能神经损伤具有保护作用，姜黄素可以减少黑质中DA能神经元的脱失，增加纹状体中DA及其代谢产物的含量以及降低DA的代谢率。姜黄素的这种保护作用可能是通过减少SN区的铁聚集从而减弱了氧化应激反应实现的。在离体细胞实验中，姜黄素可以通过提高SOD的活力以及提高细胞的ΔΨm，从而抑制了过量ROS的生成以及NF-кB由胞浆向核内的易位，进而对6-OHDA损伤的MES23.5细胞起到神经保护作用。本实验通过研究姜黄素对DA能神经元的保护作用及其可能机制，为PD的预防和治疗提供了新的可能方案，也为姜黄素的新用途和临床防治PD药物的进一步开发提供了实验依据。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

引言

第一章 姜黄素对6-OHDA损伤大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用

摘要

1.前言

2.材料和方法

3.结果

3.1姜黄素对6-OHDA损毁大鼠str内DA及其代谢产物含量的影响

3.2姜黄素对6-OHDA损毁大鼠黑质TH阳性细胞数影响

3.3姜黄素对6-OHDA损毁大鼠黑质铁染色阳性细胞数的影响

5.讨论

第二章 姜黄素对6-OHDA所致MES23.5细胞损伤的保护作用

摘要

前言

2.材料和方法

2.1细胞培养

2.2 MTT方法检测细胞存活率

2.3细胞线粒体跨膜电位的检测

2.4细胞内活性氧物质检测

2.5 SOD和NF-κB蛋白表达的检测

2.6数据处理和统计学检测

3.结果

3.1姜黄素和6-OHDA对MES23.5细胞活力的影响

3.2姜黄素预处理对6-OHDA损伤的MES23.5细胞有保护作用

3.3姜黄素预处理抑制了6-OHDA所导致MES23.5细胞的△Ψm的降低

3.4姜黄素预处理抑制了6-OHDA所导致的MES23.5细胞ROS的升高

3.5姜黄素预处理可以上调6-OHDA所导致的MES23.5细胞SOD的表达水平

3.6姜黄素预处理可以调节6-OHDA所导致的MES23.5细胞的NF-κB的核易位

4讨论

结论

参考文献

综述：姜黄素的生物学作用

在学期间发表及待发表的文章、参加的学术会议及摘要、参与课题

致谢