转化生长因子β1对支气管哮喘患者肺成纤维细胞的作用研究

摘要

目的：通过观察转化生长因子β1(TGF-β1)对支气管哮喘患者肺成纤维细胞增殖和分泌的影响，探讨二者在支气管哮喘气道重塑中的作用和关系。
　　 方法：采用组织块贴壁法和酶消化法，分离和原代培养支气管哮喘患者肺成纤维细胞，免疫荧光法进行鉴定。0μg/L TGF-β1浓度（对照组）、1μg/L TGF-β1浓度(A组)、5μg/L TGF-β1浓度（B组）、10μg/L TGF-β1浓度（C组）分别作用肺成纤维细胞48h，MTT法测定成纤维细胞增殖水平，Westrn blot检测α-SMA蛋白的表达，RT-PCR法分别测定在以上不同TGF-β1浓度作用48h下，肺成纤维细胞Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)的mRNA表达水平。
　　 结果：组织块贴壁法成功地培养出了肺成纤维细胞，酶消化法未能成功。组织块接种第6d时有少量细胞于其周围爬出，呈长梭形或者三角形，约25d细胞铺满瓶底，用自然纯化和差速贴壁法纯化细胞，胰酶消化法传代培养，并且可以进行冻存与复苏。免疫荧光法鉴定原代培养出的细胞，成纤维细胞因表达波形蛋白而染成绿色，证明该实验研究的细胞为肺成纤维细胞。MTT法检测结果示:不同浓度的TGF-β1均可刺激哮喘患者肺成纤维细胞增殖，呈浓度依赖性(P＜0.05)。Weternblot结果显示:不同浓度的TGF-β1作用下，成纤维细胞可表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，其表达水平与TGF-β1呈明显的浓度依赖关系(P＜0.05)。RT-PCR法检测结果示:在不同浓度的TGF-β1诱导下，成纤维细胞CollagenⅠ mRNA和CollagenⅢ mRNA的表达水平表达上调，均随着TGF-β1的浓度增高而增高，呈浓度依赖性(P＜0.05)。
　　 结论：组织块贴壁法是一种较为可靠的肺成纤维细胞分离和原代培养方法。在支气管哮喘发病机制中，TGF-β1可促进肺成纤维细胞的增殖，诱导其向肌成纤维细胞转化而被激活，合成和分泌CollagenⅠ和CollagenⅢ，从而引起支气管哮喘患者气道粘膜下纤维化，胶原沉积，由此导致了支气管哮喘患者的气道重塑。

目录

摘要

引言

第一章 试剂及仪器

1．1 肺组织来源

1．2 试剂与耗材

1．3 仪器

第二章 方法

2．1 主要试剂的配制

2．1．1 磷酸盐缓冲液PBS溶液的配制

2．1．2 20％胎牛血清的α-MEM培养基的配制

2．1．3 10％胎牛血清的α-MEM培养基的配制

2．1．4 5％胎牛血清的α-MEM培养基的配制

2．1．5 细胞冻存液的配制

2．1．6 柠檬酸溶液的配制

2．1．7 配制各种不同浓度组的TGF-β1

2．1．8 MTT溶液的配制

2．1．9 0．3％Trition-100溶液的配制

2．1．10 4％多聚甲醛溶液的配制

2．1．11 2％琼脂糖凝胶的配制

2．1．12 1×转膜液的配制

2．1．13 buffer的配制

2．1．14 电泳缓冲液的配制

2．1．15 1×转膜液的配制

2．1．16 1×PBST的配制

2．1．17 一抗稀释液的配制

2．2 支气管哮喘肺成纤维细胞的原代培养

2．2．1 肺组织的无菌切取

2．2．2 支气管肺成纤维细胞组织块贴壁法培养

2．2．3 支气管肺成纤维细胞胰酶消化法原代培养

2．2．4 细胞计数法

2．2．5 支气管哮喘患者肺成纤维细胞的传代培养

2．2．6 支气管哮喘患者肺成纤维细胞的纯化

2．2．7 支气管哮喘患者肺成纤维细胞的冻存

2．2．8 支气管哮喘患者肺成纤维细胞的复苏

2．3 支气管哮喘患者肺成纤维细胞的鉴定

2．4 四甲基偶氮唑盐(MTT法)微量比色法检测TGF-β1对支气管哮喘患者肺成纤维细胞作用影响

2．5 Westrn blot检测α-SMA蛋白的表达

2．5．1 细胞干预

2．5．2 细胞总蛋白的提取

2．5．3 检测α-SMA蛋白的表达

2．5．4 膜的再利用

2．6 逆转录聚合酶链式反应(PT-PCR)检测肺成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达水平

2．6．1 细胞干预

2．6．2 TRIzol法提取细胞总RNA

2．6．3 RNA纯度与浓度的测定

2．6．4 逆转录反应cDNA的合成

2．6．5 PCR扩增

2．6．6 PCR产物观察

2．7 统计学处理

第三章 实验结果

3．1 支气管哮喘患者肺成纤维细胞的原代培养

3．2 支气管哮喘患者肺成纤维细胞的鉴定

3．3 MTT法检测TGF-β1对肺成纤维细胞作用影响

3．4 Westrn blot检测α-SMA蛋白表达结果

3．5 TGF-β1对支气管哮喘患者成纤维细胞Collagen Ⅰ和CollagenⅢ的mRNA表达水平的影响

3．5．1 TGF-β1对支气管哮喘患者成纤维细胞CollagenⅠ mRNA表达水平的影响

3．5．2 TGF-β1对支气管哮喘患者成纤维细胞Collagen-Ⅰ的mRNA表达水平的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

攻读学位期间成果

致谢

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