转录组测序鉴定EB病毒相关胃癌差异表达基因及基因多态性的研究

摘要

目的：①筛选胃癌细胞系AGS稳定感染EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)后转录表达发生改变的特异基因，以及出现的特异基因结构变化，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)、可变剪切(alternative splicing，AS)、插入/缺失(insertion/deletion，Indel)等，并对AGS细胞系中EBV病毒基因的表达进行分析。②选取转录组测序筛选出的由于EBV感染诱发的部分差异表达基因和单核苷酸多态性变异进行验证和比较分析，为筛选与 EBVaGC发生、浸润、转移和预后等有关的分子标记物，阐明EBV致癌机制及寻找EBVaGC早期诊断、预后判断和治疗的新靶点提供实验基础和理论依据。
　　方法：①采用高通量转录组测序技术对AGS细胞系和稳定感染EBV的AGS-EBV细胞系进行转录组测序，生物信息学技术对测序数据进行分析，包括测序数据的预处理、基因组比对、差异表达基因分析、差异基因mRNA GO(Gene Ontology)富集分析、差异基因mRNA KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析以及 EBV表达基因分析。②提取 AGS细胞系和AGS-EBV细胞系以及EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901，MKN-45，HGC-27)和EBV阳性细胞系(GT38，GT39，SNU719)总RNA，采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)对转录组测序筛选出的部分表达差异且与肿瘤关系密切的基因(REG4、VEGF、LYPD3、ASNS、NDRG1和APEX1)的转录表达进行验证。并采用免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC组织中REG4基因的表达。③选择山东地区胃癌组织标本，提取新鲜胃癌组织和石蜡包埋胃癌组织 DNA，PCR结合 DNA测序或限制性片段长度多态性技术(restrictive fragment length polymorphisms，RFLP)检测EBVaGC和EBVnGC组织中EDAR，WDR62，GPC4，FLG,CTH，CPOX，SPG11，CASC5及ZFYVE27基因编码区特定位点SNP(rs3827760,rs1008328，rs1048369，rs2065955，rs1021737，rs1131857，rs3759871，rs7177192以及rs1088299的分布。其中FLG，CPOX和CTH基因扩增产物分别选择限制性核酸内切酶Apal I、HaeIII、ApoI酶切进行限制性片段长度多态性分析，其余6种基因的PCR产物均送上海迈浦基因有限公司采用末端终止法进行双向测序，Chromas软件查看测序峰图文件，DNAStar软件(Larsergene，version7.0)进行序列剪接和对比分析，并与相应基因序列及基因文库库中的标准序列进行对比分析。
　　结果：①与AGS细胞系比较，稳定感染EBV后，AGS-EBV细胞系共有3880条基因mRNA出现表达差异，其中1651条基因表达上调，2229条基因表达下调。
　　②差异转录表达mRNA GO富集分析结果表明，有较多基因参与蛋白结合、细胞质、膜整合、细胞膜、细胞核和金属离子结合等GO term；共有946差异基因涉及与肿瘤相关的信号转导、细胞凋亡、细胞增生、细胞黏附、肿瘤抑制以及免疫相关等功能，其中上调基因360条，下调基因586条。
　　③差异表达基因的KEGG分析结果显示，较多差异表达基因参与代谢途径、肿瘤途径、细胞内吞以及灶性粘附等途径。
　　④AGS细胞稳定感染EBV后，细胞基因出现特征性的结构改变，包括SNP、AS和INDEL等，某些改变可能与差异表达基因相关。
　　⑤EBV稳定感染的AGS细胞中，共检测到65种EBV基因表达，以表达量计算前10位表达的EBV基因分别为 BXLF2，BXLF1，LF3，BVRF1，BMRF2，BHLF1，LMP2，BILF1，BILF2以及BVLF1。
　　⑥EBV阳性和阴性胃癌细胞系中，REG4、VEGF、LYPD3、ASNS、NDRG1和APEX1基因表达差异倍数和表达趋势与AGS和AGS-EBV两种细胞系转录组测序结果一致。
　　⑦免疫组化检测结果显示，48例EBVnGC组织中有4例癌细胞中观察到REG4阳性信号，而42例EBVaGC组织均为阴性；统计学分析表明，2种胃癌组织中REG4表达无显著性差异(P=0.12)。
　　⑧SNP分析结果显示，分别有43例EBVnGC和41例EBVaGC组织EDAR基因扩增和测序成功，2种胃癌组织中该基因rs3827760位点多态性分布无显著性差异(χ2=0.17，P=0.94)。分别有50例EBVnGC和36例EBVaGC组织WDR62基因扩增测序成功，2种胃癌组织中该基因rs1008328位点多态性分布无显著性差异(χ2=0.68，P=0.79)。分别有47例EBVnGC和36例EBVaGC组织GPC4基因扩增和测序成功，2种胃癌组织中该基因rs1048369位点多态性分布具有显著性差异(χ2=10.17，P=0.006)，基因型AA(61.11％)和等位基因A(61.11%)是EBVaGC发病的危险因素。分别有48例EBVnGC和43例EBVaGC组织FLG基因PCR扩增及酶切成功，2种胃癌组织中该基因rs2065955位点多态性分布具有显著性差异(χ2=7.69,P=0.021)，基因型 CC(54.17%)和等位基因 C(70.83%)是EBVnGC发病的危险因素。分别有40例EBVnGC和31例EBVaGC组织CTH基因PCR扩增及酶切成功，2种胃癌组织中该基因rs1021737位点多态性的分布无显著性差异(χ2=1.44,P=0.60)。分别有46例EBVnGC和56例EBVaGC组织CPOX基因扩增及酶切成功，2种胃癌组织中该基因rs1131857位点多态性的分布无统计学意义(χ2=0.60,P=0.74)。分别有54例EBVnGC和40例EBVaGC组织SPG11基因扩增和测序成功，2种胃癌组织中该基因 rs3759871位点多态性的分布无显著性差异(χ2=0.55，P=0.75)。有42例EBVnGC和29例EBVaGC组织CASC5基因扩增并测序成功，2种胃癌组织中该基因rs7177192位点多态性的分布并无显著性差异(χ2=0.99,P=0.61)。分别有56例EBVnGC和37例EBVaGC组织ZFYVE27基因扩增并测序成功，2种胃癌组织中该基因rs10882993位点多态性的分布无显著性差异(χ2=1.13,P=0.58)。
　　结论：①AGS细胞感染 EBV后出现特异表达差异的基因，下调基因多于上调基因。在对差异基因的GO富集分析和KEGG分析显示这些基因参与到特定的功能和信号途径，提示EBV可通过特异的作用机制参与EBVaGC的发生发展。
　　②EBV稳定感染可导致 AGS细胞某些基因结构出现特征性的改变，提示EBV可通过改变宿主细胞基因结构而诱发其表达发生变化。
　　③EBV稳定感染的AGS细胞中可检测到多种病毒基因的表达，包括潜伏期基因和裂解期基因，推测某些病毒基因的表达是导致宿主细胞出现基因差异表达和基因结构发生特征性改变的原因。
　　④EBV感染后能引起宿主细胞某些肿瘤相关基因的差异表达，EBV感染对宿主细胞基因表达的影响具有普遍性。
　　⑤山东地区 GPC4基因 rs1048369位点和FLG基因 rs2065955位点与EBVaGC密切相关；GPC4基因AA基因型和等位基因A是EBVaGC致病危险因素；FLG基因CC基因型和等位基因C则是EBVnGC的致病危险因素。

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第一部分 胃癌细胞系AGS感染EB病毒前后转录组测序分析研究

中文摘要

Abstract

引言

第一章 材料与方法

第二章 结果

第三章 讨论

研究结论

参考文献

第二部分 EBVaGC组织中差异表达基因及基因多态性研究

中文摘要

ABSTRACT

引言

第一章 材料与方法

第二章 结 果

第三章 讨论

研究结论

参考文献

附：英文缩写词索引

综述：　高通量测序技术在EB病毒相关研究中的应用

攻读学位期间的学术成果

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