源于条斑紫菜的抗菌肽制备、固相合成及其作用机理研究

摘要

本文以条斑紫菜(Porphyrayezoensis)为原料，提取不同溶解性蛋白质后进行酶解并对酶解条件进行优化，获得对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有显著抗菌作用的酶解物备后续使用。
　　将上述获得的酶解物应用超滤、Sephadex C-25离子交换层析、Sephadex G-25分子筛层析、毛细管高效液相色谱以及质谱分析进行分离纯化、测序，在此基础上固相合成抗菌肽，并对该抗菌肽的主要理化性质以及抗菌机理进行研究。
　　研究结论如下：
　　1.条斑紫菜蛋白质提取及酶解条件优化
　　将提取的水溶性、酸溶性、盐溶性和碱溶性蛋白质分别用6种酶进行酶解，将所得24种酶解物采用琼脂孔穴扩散法对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、四联微球菌（Micrococcus tetragenus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）以及大肠杆菌（Escherichia coli）四种细菌进行抗菌活性测定。其中，水溶性蛋白质在硫酸铵饱和度为40-50％时沉淀所得蛋白质的胃蛋白酶酶解物中分子量小于5 KD的级分，对金黄色葡萄球菌抗菌效果最为明显。最优酶解条件为温度40℃、加酶量2％、pH1.5、时间2h。
　　2.条斑紫菜抗菌肽的纯化、测序及固相合成
　　经超滤、层析纯化得到的组份进行混合质谱鉴定，从中筛选出具有最佳抗菌活性的多肽序列TPDSEAL，分子量为732Da，等电点为pH5.34。通过APD数据库进行分析和比对，发现与其同源性最高的5种抗菌肽AP01211、AP01344、AP02431、AP01212、AP01210相似度均在45%以下。采用固相合成法，该抗菌肽已经成功合成。
　　3.条斑紫菜抗菌肽的理化性质及作用机理研究
　　理化性质：
　　1.对介质pH及温度变化、紫外线处理都较为稳定。
　　2.吸水性强，宜干燥保存；吸油率较好，可添加到香肠等肉类制品以及油饼等高油食品中，使产品组织细腻口感好，同时起到防腐保鲜作用。
　　作用机理：
　　①抗菌肽显著抑制金黄色葡萄球菌生长，致使其生长不能出现正常的对数生长期。
　　②随着培养时间的延长，培养液中碱性磷酸酶的含量、蛋白质含量、β-半乳糖苷酶的含量和电导率值逐渐增加，推测可能由于抗菌肽作用致使细胞破损，细胞的通透性增强，从而导致胞内物质严重外流。
　　③扫描电镜下，金黄色葡萄球菌的菌体最初是光滑、均匀、饱满的；经抗菌肽处理后的菌体表面模糊、菌体不规则；随时间培养时间延长，细胞壁出现破损，细胞壁发生粘连，胞内物质外流，视野内菌体呈模糊状。
　　④透射电镜下，正常的菌体质壁结合紧密，菌体规则、圆滑，胞内物质分布均匀；经抗菌肽处理后，可见明显质壁分离、细胞质固缩，内部出现空腔或菌体破裂，内容物流出，菌体裂解死亡。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

引言

第一章 条斑紫菜抗菌肽的制备与活性分析

1.1 实验材料、试剂与仪器

1.2 实验方法

1.3 结果与分析

1.4 小结

第二章 抑菌活性肽的纯化、测序及固相合成

2.1实验材料、试剂与仪器

2.2实验方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

第三章 条斑紫菜抗菌肽的理化性质及作用机理研究

3.1 实验材料、试剂和仪器

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 小结

结论

参考文献

综述

1 紫菜概述

2 紫菜蛋白、多糖的生物学活性研究

3 抗菌肽概述

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

声明