条斑紫菜(Porphyra yezoensis)R-藻红蛋白的制备及其抗氧化、抗肿瘤活性研究

摘要

我国藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国，集中在江苏沿海的养殖和加工，其产量占全国的95％以上。紫菜中丰富的藻红蛋白，因其抗氧化、抗癌、增强免疫力等功效，在食品、化妆品、医疗等领域得到日益广泛的应用。本文以江苏产量丰富的条斑紫菜为原料，制备了R-藻红蛋白，对其结构特性进行了研究，并通过体外活性试验评价了其生物活性，具体结果如下：
　　 条斑紫菜经超声细胞破碎、硫酸铵二次盐析、超滤膜超滤、结晶一周后，提取得到的R-藻红蛋白纯度为2.05，达到药品级要求（A562nm/A280nm>2）。用DEAECellulose-52（2.6×40 cm）层析纯化R-藻红蛋白，NaCL浓度为0.2 mol/L时，洗脱出R-藻红蛋白主峰，洗脱液呈粉红色，纯度最高达5.24，符合试剂级要求（A562nm/A280nm>4）。
　　 通过紫外-可见光谱鉴定DEAE Cellulose-52柱层析得到的试剂级R-藻红蛋白的纯度，吸收波长为562nm，540 nm处有一肩峰。SDS-PAGE电泳分离得到R-藻红蛋白的α和β亚基，α亚基的相对分子质量约为16 kDa，β亚基的相对分子质量约为19 kDa。荧光光谱分析得到，条斑紫菜纯R-藻红蛋白的激发波长为477 nm，最适发射波长为在572 nm。
　　 傅立叶转换红外光谱（FTIR）测定结果显示，药品级R-藻红蛋白，在1656cm-1和1454cm-1之间的双峰表明R-藻红蛋白结构中存在共轭双键。R-藻红蛋白中，含有除色氨酸外的7种必需氨基酸，占氨基酸总量的37％，含量从高到低的顺序是：亮氨酸>缬氨酸>苏氨酸>异亮氨酸>赖氨酸>苯丙氨酸>蛋氨酸。在所有的氨基酸中，呈鲜味浓的谷氨酸的含量最多，其次是丙氨酸和天门冬氨酸。
　　 R-藻红蛋白的还原力测定、羟自由基和超氧阴离子清除率的测定，证实R-藻红蛋白具有较强的还原力和抗氧化作用，对羟自由基清除率的IC50值为608.9μg/mL，在超氧阴离子清除实验中，对邻苯三酚自氧化速率的抑制率高达80.7％。
　　 R-藻红蛋白对人胃癌细胞SGC和乳腺癌细胞MCF进行的48h抑制作用研究结果表明，在实验剂量范围内，随R-藻红蛋白浓度的增加而抑瘤作用增大。对SGC的抑制，R-藻红蛋白浓度为800μg/mL时，抑制率为23.58％。当R-藻红蛋白的浓度为200μg/mL时，对MCF的抑制即达30.03％；R-藻红蛋白浓度增至1600μg/mL，其抑制率超过50％。R-藻红蛋白对两种癌细胞的抑制都呈剂量正向关系。
　　 Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的药品级R-藻红蛋白作用SGC48h凋亡诱导的作用情况，对照细胞的总凋亡比例为5.04％，100、200、400、800、1600μg/mL不同浓度的R-藻红蛋白组细胞总凋亡比例分别为9.21％、5.80％、7.02％、9.71％和9.31％；R-藻红蛋白对MCF细胞的凋亡诱导实验中对照组的总凋亡比例为0.56％，而100、200、400、800μg/mL不同浓度的R-藻红蛋白组细胞总凋亡比例分别为38.68％、19.17％、20.99％和24.76％。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1 紫菜藻红蛋白的研究进展

1.2 藻红蛋白的提取、纯化方法

1.3 藻红蛋白的理化特征

1.4 藻红蛋白的生物活性及利用

1.4.1 抗氧化

1.4.2 抗肿瘤

1.4.3 提高免疫力

1.4.4 荧光探针

1.4.5 肿瘤治疗

1.4.6 天然色素

1.5 本研究的研究意义及主要研究内容

1.5.1 本论文的研究意义

1.5.2 本论文的主要研究内容

参考文献

第二章 条斑紫菜R-藻红蛋白的制备

2.1 材料与方法

2.1.1 主要原料及试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3 条斑紫菜原料的预处理

2.1.4 条斑紫菜R-藻红蛋白浓度和纯度的测定

2.1.5 条斑紫菜R-藻红蛋白的提取工艺流程

2.1.6 统计方法

2.2 结果与讨论

2.3 本章小结

参考文献

第三章 条斑紫菜R-藻红蛋白的理化特征

3.1 材料与方法

3.1.1 主要原料及试剂

3.1.2 主要仪器

3.1.3 紫外-可见光谱测定

3.1.4 SDS-PAGE亚基分析

3.1.5 荧光光谱测定

3.1.6 傅立叶转换红外光谱(FTIR)

3.1.7 氨基酸组成分析

3.2 结果与讨论

3.2.1 紫外-可见光谱

3.2.2 SDS聚丙烯胺凝胶电泳

3.2.3 R-藻红蛋白的荧光光谱

3.2.4 R-藻红蛋白的FTIR光谱分析

3.2.5 氨基酸组成分析

3.3 本章小结

参考文献

第四章 条斑紫菜R-藻红蛋白的In vitro抗氧化、抗肿瘤活性研究

4.1 材料与方法

4.1.1 主要材料及试剂

4.1.2 主要仪器

4.1.3 R-藻红蛋白还原力的测定

4.1.4 R-藻红蛋白清除羟基自由基能力的测定

4.1.5 R-藻红蛋白清除超氧阴离子自由基能力的测定

4.1.6 MTT 试验

4.1.7 流式细胞仪检测

4.2 结果与讨论

4.2.1 R-藻红蛋白的还原力

4.2.2 R-藻红蛋白清除羟自由基的能力

4.2.3 R-藻红蛋白清除超氧自由基的能力

4.2.4 R-藻红蛋白对SGC细胞和MCF细胞的抑制作用

4.2.5 Annexin V-FITC/PI法检测凋亡细胞

4.3 本章小结

参考文献

全文总结

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文