纳豆菌发酵蛤蜊工艺及其发酵物中多糖、醇溶物研究

摘要

为了高值化利用蛤蜊资源，本文利用纳豆菌(Bacillus natto)发酵蛤蜊（Ruditapes philippinarum），主要探讨并解决了如下问题：
　　1、研究发酵产物中游离氨基酸态氮的含量及纳豆激酶活性，并以二者为评价指标，探索其最佳发酵工艺条件。经单因素和正交设计试验结果表明：温度为43℃，接种量为0.6％，发酵时间为48 h，料水比为1:2时发酵产物中游离氨基酸态氮含量最高（转化率可达73.10%）；温度为41℃，接种量为0.8%，发酵时间为48 h，料水比为1:3时发酵产物中纳豆激酶活性最高。
　　2、研究了发酵物中多糖的提取、纯化、组成及其生物活性。采用传统的水提法将纳豆菌发酵蛤蜊产物中的粗多糖提取出来（提取率为6.5%），并借助DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephacry-400凝胶柱对其进行了分离纯化，分别得到纯度为93.92%，89.91%，83.73%的三种多糖：XJW-1，XJW-2和XJW-3。对上述三种多糖进行蛋白质含量、硫酸根含量和氨基糖含量测定。结果为XJW-1蛋白质含量为1.03%，氨基糖含量为1.03%，硫酸根含量较少，产率为0.20%；XJW-2蛋白质含量为0.22%，不含有氨基糖，含有微量的硫酸根离子，产率为0.19%；XJW-3蛋白质含量为1.25%，不含有氨基糖，含有微量的硫酸根离子，产率为0.23%。HPLC分析结果可知：XJW-1分子量为81.68KD，单糖组成主要为Glc；XJW-2分子量为31.73KD，单糖组成主要包括Man、GlcN、Glc和Gal,其摩尔比为：Man:GlcN:Glc:Gal=1.095:1.164:96.430:1.312；XJW-3分子量为16.944KD，单糖组成主要包括Man、GlcN、Glc和Gal，其摩尔比为：Man:GlcN:Glc:Gal=14.23:13.98:73.11:1.32。抗氧化活性和抗肿瘤活性研究结果表明，这三种多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基都有明显的清除效果，总还原力，均强于粗多糖，其中对羟基自由基的清除能力高于同浓度Vc。总体而言，这三种多糖的抗氧化活性顺序为：XJW-3>XJW-2>XJW-1；三种多糖对神经胶质瘤细胞、人子宫颈鳞癌细胞、神经母细胞瘤细胞和子宫颈癌细胞的增殖抑制率均呈现时间及剂量依赖性，随着多糖浓度的升高和培养时间的延长（每24h加一次多糖样品），对肿瘤细胞的抑制率越高。其中，三种多糖对人子宫颈鳞癌细胞的增殖抑制作用最强，其次依次为神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞和子宫颈癌细胞。经多糖处理过的的四种癌细胞，均发生了不同类型的细胞形态改变，促使细胞数目减少或打断了细胞之间的紧密连接，或使细胞发生结团现象，甚至直接使细胞发生破裂。其具体作用机制尚待进一步研究。
　　3、将纳豆菌发酵蛤蜊产物中的醇溶物经分级萃取得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相。抑菌活性实验结果表明，乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌效果优于石油醚相和正丁醇相，故后续实验中将乙酸乙酯相作为实验材料，并将金黄色葡萄球菌作为以后活性追踪的指示菌种。通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、HPLC等分离纯化方法从纳豆菌发酵蛤蜊中分离纯化得到四种化合物，通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱等技术，结合理化性质和文献对照对其中两种化合物结构进行了鉴定，确定这两种化合物为：麦角甾醇，胆甾醇。

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引言

第一章 不同条件对纳豆菌发酵蛤蜊产物中游离氨基酸态氮及纳豆激酶活性的影响

1.1实验试剂、仪器、材料

1.1.1 试剂

1.1.2 仪器电子天平

1.1.3 材料

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理

1.2.2 指标测定

1.2.3 蛤蜊肉以纳豆菌发酵的单因素试验以及正交试验

1.2.4 实验数据处理方法

1.3 结果与讨论

1.3.1 单因素试验

1.3.2 正交试验

1.4 小结

第二章 蛤蜊发酵物中多糖及其生物活性研究

2.1 实验试剂 仪器 材料

2.1.1 试剂

2.1.2 仪器

2.1.3 材料

2.2实验方法

2.2.1 胞外多糖提取分离

2.2.2 胞外多糖的理化性质分析

2.2.3 纯度和分子量分析

2.2.4单糖组成分析

2.2.5水分含量的测定[42]

2.2.6红外光谱分析

2.2.7抗氧化的测定

2.2.8抑菌实验

2.2.9 抗肿瘤细胞增殖

2.3 结果与分析

2.3.1 发酵物中粗多糖的提取率

2.3.2 粗多糖中蛋白含量的测定结果

2.3.3 多糖的分离纯化：

2.3.4 理化性质及分子量分析

2.3.5 分子量及纯度分析

2.3.6 单糖组成分析

2.3.7 IR分析

2.3.8 抗氧化的测定结果

2.3.9 抑菌活性测定结果

2.3.10 抗肿瘤活性测定结果

2.4 小结

第三章 发酵产物中醇溶物的分离鉴定及抑菌活性分析

3.1 实验材料、试剂与仪器

3.1.1 实验试剂

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 提取物浸膏的获得

3.2.2 单体化合物的分离与纯化

3.2.3 单体化合物的结构表征

3.3 实验结果与分析

3.3.1 乙醇粗提物的抑菌活性

3.3.2 石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三相浸膏抑菌活性

3.3.3 乙酸乙酯相浸膏对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度（MIC）

3.3.4 结构鉴定结果

3.4 小结

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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