先天性甲减(CH)致病基因(TTF-1、TTF-2、NKX2.5、PAX8、TSHR及NIS)突变筛查研究

摘要

先天性甲状腺功能减低症（congenital hypothyroidism, CH）属于新生儿中最常见的内分泌疾病，主要通过新生儿筛查发现，若不及时诊断并治疗会造成患儿智力和身体发育的不可逆性损害。其主要分为两种：甲状腺发育异常（约占85%-90%），甲状腺激素合成障碍（约占10%-15%）。其中甲状腺发育异常包括缺如、异位、发育不良三种形式，病因不详，可能与某些基因（如TSHR）或转录因子（TTF-1、TTF-2、PAX8）的突变有关；而甲状腺激素合成障碍属于常染色体隐性遗传，可能与DUOXA2、DUOX2、NIS等基因的突变有关。
　　本研究共分为两章，第一章：CH伴甲状腺肿大患儿的NIS基因突变筛查。
　　目的：NIS基因的突变与甲状腺激素合成障碍相关，在CH伴甲状腺肿大患者中进行NIS基因突变的筛查，以研究NIS基因突变类型、特点以及与临床表型的关系。
　　方法：收集110例CH伴甲状腺肿大患儿（所选患儿都已经过DUOX2、DUOXA2等与甲状腺激素合成障碍相关基因的筛查）的血液样本，从外周血白细胞中提取全基因组DNA，通过聚合酶链反应扩增NIS基因所有外显子以及内含子与外显子交界部位，并进行测序分析。
　　结果：在非血缘关系的家庭中，虽然未发现NIS基因的致病突变，共发现有2个错义突变（p.A514S、p.R569W），一个同义突变（p.L408=）和6个单核苷酸多态性（SNP）位点（IVS5-51、IVS6+11、IVS8+22、IVS14-8、IVS14+22、IVS14+28）。
　　结论：在山东省内CH伴甲状腺肿大患儿中，NIS基因的突变率较低。在这项研究中虽发现两个罕见的变体（p.A514S、p.R569W），但需要进一步研究，以确定这些变体是否有功能的改变，或患儿是否有其他原因所致。
　　第二章：采用二代测序技术对CH伴甲状腺缺如患儿基因筛查研究。
　　目的：转录因子（TTF-l、TTF-2、PAX8、NKX2.5）和促甲状腺激素受体因子（TSHR）的基因突变与甲状腺发育异常（TD）相关，而甲状腺缺如是TD的一种临床表现类型。通过对上述候选基因的筛查，在山东省内CH伴甲状腺缺如患儿中建立基因型与表型的关系。
　　方法：利用二代测序技术对TTF-1、TTF-2、PAX8、NKX2.5、TSHR基因的全部外显子以及侧翼序列进行筛查，并对带有可疑基因突变的DNA样本进行sanger验证，以排除假阳性，并对发现变体的突变频率与数据库中的进行比较。
　　结果：在TSHR基因中共发现有7个变体（p. P52T、p.R450H、p.C700E、p.G132R、p.M164K、p.A522V、p.R528S），TTF-2基因中发现有1个变体（p.P243T）,NKX2.5基因中发现一个变体（p.N291I），TTF-1基因中发现有5个变体（p.G360V、p.R401Q、p.L418I、p.G44N、p.E453Q），PAX8基因中发现有2个变体（p.A355V、c.-26G>A）。其中位于TSHR中p.G132R、p.M164K、p.A522V在已有的数据库资料中均未找到，为首次发现，并且p.G132R和p.M164L在同一患者中被发现。以及位于TSHR基因中的p.R450H和位于NKX2.5基因中的p.N291I在同一患者中被发现，位于TSHR基因中的p.R450H和位于PAX8基因中的p.A355V也在同一患者中被发现。
　　结论：在山东地区CH伴甲状腺缺如患者中TSHR突变发生率较高约为7%，突变图谱的多样性。我们的研究进一步扩大了基因突变图谱，突变多位于高度保守的序列，且多位于重要结构域，TSHR基因突变可能为CH的致病基因，具体机制需要进一步的功能验证。与之相反，TTF-l、TTF-2、PAX8、NKX2.5等基因的突变率较低，不是CH伴甲状腺缺如患儿的主要致病突变。

目录

引言

第一章 CH伴甲状腺肿大患儿的NIS基因突变筛查

1.1 研究对象

1.2 研究材料与设备

1.2.1 主要实验试剂

1.2.2 主要实验仪器

1.2.3 实验主要软件及数据库

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA提取

1.3.2 DNA质量检测

1.3.3 引物设计与保存

1.3.4 PCR扩增反应

1.3.5 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

1.3.6 PCR产物测序并结果分析

1.4 实验结果

1.4.1 NIS基因突变筛查结果

1.4.2 突变位点多物种同源性比较

1.5 讨论

1.6 结论

第二章 采用二代测序技术对CH伴甲状腺缺如患儿基因筛查研究

2.1 研究对象

2.2 材料与设备

2.2.1主要仪器

2.2.2 主要试剂

2.3生物信息数据库与分析软件

2.4 研究基本流程

2.4.1 全基因组DNA的提取并进行DNA质量的检测

2.4.2 基因组文库的制备

2.4.3 DNA簇(clusters)的生成

2.4.4 DNA簇在Genome Analyzer上边合成边测序

2.4.5 结果进行生物信息学及统计学分析

2.5 目标基因sanger测序验证

2.5.1 可疑突变位点设计引物并合成

2.5.2 PCR扩增

2.6 实验结果

2.6.1 基因分析

2.6.2 统计分析及结果

2.6.3 基因型和表型关联性分析

2.7 讨论

2.8 结论

参考文献

综述:先天性甲状腺功能减低症致病相关的分子遗传学研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢

声明