高活性突变体构成的基因编辑工具及制备方法和修复先天性视网膜劈裂症致病基因的方法

摘要

本发明公开一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具及其制备方法以及用于修复X连锁先天性视网膜劈裂症致病基因的方法，其特点是利用人类细胞进行体外定向进化筛选获得具有高活性的FnCpf1突变体Q125R，其表达载体为Addgene plasmids#69976；切割目标DNA的向导为crRNA，其表达载体pJET‑U6‑crRNAs；基因编辑用报告细胞系为293‑SC1和293‑RS1；mRS1基因同源重组修复模板为合成单链脱氧核糖核苷酸。该高活性FnCpf1突变体的获得包括建立FnCpf1突变体库、筛选具有高编辑活性低脱靶特点的突变体eaFnCpf1和利用eaFnCpf1对内源性基因进行编辑。该高活性突变体eaFnCpf1不仅具有较高的编辑活性，而且其可以识别更广范围的PAM，使得其在一定程度上丰富了基因编辑工具的“技能”，有助于扩大基因编辑在生物医学领域的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及新型基因组编辑技术，在生命科学(含医学)具有广泛的应用前景，具体涉及一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具。本发明还涉及上述一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具的制备方法。本发明还涉及一种采用上述eaFnCpf1基因编辑器用于修复X连锁先天性视网膜劈裂症致病基因的方法。

背景技术

基因编辑技术是指利用基因编辑工具对特定基因进行目的性修饰。目前，基因编辑工具主要有锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和规律成簇间隔短回文重复Cas蛋白核酸内切酶系统(clustered regulatory interspaced short palindromicrepeat(CRISPR)/Cas-based RNA-guided DNA endonuclease)。该系统作为细菌和古细菌长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御体系，通过将入侵者DNA整合到间隔序列中形成免疫记忆，利用CRISPR RNAs(crRNAs)靶向引导Cas蛋白对同源序列DNA进行切割和修饰。其中，II型的组成较为简单，仅Cas蛋白以及向导RNA(guidanceRNA)。目前应用较广泛的有CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a(包括FnCpf1)，相比于CRISPR-Cas9，Cpf1有蛋白结构简单、分子量较小和单链crRNA短的优点。FnCpf1识别的PAM序列是5’-KYTV-3’(Y是T或C，V是A、C或G)，较之其他更为灵活，弥补了Cas9只能靶向富含嘌呤的PAM序列，大大扩宽了基因编辑工具的靶向范围。但是，在某些位点上，Cpf1的编辑效率和对PAM的选择范围尚不能中分满足科研工作的需要。

已经有相关研究经优化得到AsCpf1突变体，RR变异体(S542R/K607R)和RVR变异体(S542R/K548V/N552R)，它们识别PAM 5’-TATV-3”和5’-TYCV-3”。在理论上，FnCpf1的编码序列的进化可以调整基因组编辑活性和保真性。因此，我们试图设计用人类细胞定向进化FnCpf1，以获得活性更高的FnCpf1突变体，从而应用于人类基因工程的研究和疾病治疗的临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种在人类细胞中具有增强活性的基因编辑工具eaFnCpf1，利用其高活性、高保真性和更灵活的PAM识别性拓宽基因编辑技术的应用范围。

为此，本发明提供的一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具，突变体为Q125R，编码ATG的第一个氨基酸定义为1号氨基酸残基，在人源细胞中具有较FnCpf1更高的DNA切割活性和低脱靶率，被优化的底物为野生型FnCpf1，其表达载体为Addgene plasmids#69976；切割目标DNA的向导为crRNA，其表达载体为pJET-U6-crRNAs；基因突变方法为利用安捷伦诱变试剂盒靶向性突变目的片段；基因编辑用报告细胞系为293-SC1和293-RS1；mRS1基因同源重组修复模板为合成单链脱氧核糖核苷酸。

本发明提供的一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

A、高活性eaFnCpf1来源于FnCpf1突变质粒库，FnCpf1突变质粒库的构建：

(1)易错PCR试剂盒靶向性诱变FnCpf1，改变WED和REC结构域；

(2)碱基突变后的FnCpf1通过无缝克隆构建表达载体，得到Library I、LibraryII和Library III三个突变库，备用于编辑细胞基因；

B、系统性筛选高活性突变体：

(1)构建靶向GFP、长21nt的crRNA的表达载体pJET-U6-crRNA-site A(后根据其靶向GFP的位置顺序更名为pJET-U6-crRNA-site 5)；

(2)293-SC1细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.9×10

(3)将野生型FnCpf1或其突变体和pJET-U6-crRNA-site 5表达载体转入上述293-SC1细胞中，在荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达情况；

(4)细胞被转染后48h，消化并收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对目标基因编辑的效率，得到430个FnCpf1突变体，其活性较野生型有所提高；

C、检测初次筛选出的430个高活性突变体的脱靶效应：

(1)分别突变上述crRNA-site 5序列上+1、+5、+10、+15和+20位核糖核苷酸，使之与与靶标DNA错配；构建相应的表达载体pJET-U6-crRNA-M5-1、pJET-U6-crRNA-M5-2、pJET-U6-crRNA-M5-3、pJET-U6-crRNA-M5-4和pJET-U6-crRNA-M5-5；

(2)293-SC1细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.9×10

(3)将pJET-U6-crRNA-M5系列表达载体依次和野生型FnCpf1转入上述293-SC1细胞中，在荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达情况；

(4)细胞被转染后48h，消化并收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1对crRNA与靶标DNA错配的容忍度；当+15位碱基错配时，WT FnCpf1的容错度最高；

(5)初次筛选出的430个高活性突变体依次与pJET-U6-crRNA-M5-4共转染293-SC1细胞，并通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对crRNA与靶标DNA错配的容忍度；初步筛选鉴定出31个可能同时兼具高活性和低脱靶率的突变体；

(6)将初步筛选鉴定出31个可能同时兼具高活性和低脱靶率的突变体依次与pJET-U6-crRNA-M5-1、pJET-U6-crRNA-M5-2、pJET-U6-crRNA-M5-3和pJET-U6-crRNA-M5-5分别共转染293-SC1细胞，并通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比进一步分析FnCpf1突变体对crRNA与靶标DNA错配的容忍度；经过综合比较，初步获得能够保持低脱靶率和在一定程度上提高了活性的6个突变体，即I-69、I-186、I-357、I-688、II-611和II-717。

优选的，增加检测位点site B(后根据其靶向GFP的位置顺序更名为site 44)再次检测上述6个FnCpf1突变体的DAN切割活性和脱靶率，包括以下步骤：

(1)构建靶向GFP、长21nt的crRNA的表达载体pJET-U6-crRNA-site B(即pJET-U6-crRNA-site 44)，并分别突变上述crRNA-site 44序列上+1、+5、+10、+15和+20位核糖核苷酸，使之与与靶标DNA错配；构建相应的表达载体pJET-U6-crRNA-M44-1、pJET-U6-crRNA-M44-2、pJET-U6-crRNA-M44-3、pJET-U6-crRNA-M44-4和pJET-U6-crRNA-M44-5。

(2)293-SC1细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.9×10

(3)根据权利要求4所筛选得到的6个突变体分别依次与pJET-U6-crRNA-site 44、pJET-U6-crRNA-M44-1、pJET-U6-crRNA-M44-2、pJET-U6-crRNA-M44-3、pJET-U6-crRNA-M44-4和pJET-U6-crRNA-M44-5载体共转入上述293-SC1细胞中，在荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达情况；

(4)细胞被转染后48h，消化并收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对目标基因编辑的效率及其错配的容忍度即保真性。

优选的，二次优化所述I-69、I-186、I-357、I-688、II-611和II-717突变体并且做筛选，包括以下步骤：

(1)等量混合I-69、I-186、I-357和I-688，使用易错PCR试剂盒靶向性诱变上述4个突变体的，改变WED和REC结构域；

(2)等量混合II-611和II-717，使用易错PCR试剂盒靶向性诱变上述2个突变体的，改变REC结构域；

(3)碱基突变后的FnCpf1通过无缝克隆构建表达载体，得到Library IV和LibraryV两个突变库，备用于编辑细胞基因；

(4)重复权利3所述的操作，系统性筛选Library IV和Library V中的突变体，得到39个具有较高活性的突变体；

(5)重复权利4所述的操作，检测二次筛选得到的39个高活性突变体的脱靶效应，去除脱靶率被提高的38个突变体，只余IV-79突变体在基因碱基效率方面得到明显提高的同时，保持了低脱靶率；

(6)重复权利5所述的操作，增加site 44位点行重复独立平行试验鉴定IV-79的切割效率提高后的稳定性、保真性和相对普遍适用性。IV-79切割活性较之野生型FnCpf1提高了40％，具有重要意义；高活性IV-79被命名为eaFnCpf1(enhanced activity FnCpf1)。

优选的，测序获得eaFnCpf1结构的变化，包括以下步骤：

(1)通过对eaFnCpf1进行Sanger测序分析，功能域第125位氨基酸Gln(Q)被Arg(R)替代；

(2)利用PyMol结构分析软件观察eaFnCpf1晶体结构的改变，Q125位于REC1结构域域的N端，与WED-II、WED-III和PI结构域一起参与PAM的识别；Q125R的替代则规避了原Q125的δ胺与Asp129的γ-羰基之间的相互作用，使得eaFnCpf1与负电荷DNA底物之间的广泛接触；

(3)通过将Q125替换成不同性质的氨基酸得到11个相应突变体，检测其在GFP上site5、site 19和site 38处的DNA切割活性，Q125R突变体(即eaFnCpf1)获得最高的切割活性。

本发明的技术效果如下：

1)eaFnCpf1在人内源性基因上的编辑效率是FnCpf1的1.93倍。

2)eaFnCpf1在非经典PAM 5’-TTCV-3’位点处同样具有较高的DNA切割活性，意味着eaFnCpf1识别PAM的灵活性也得到了提高。

3)能够将eaFnCpf1用于修复X连锁先天性视网膜劈裂症(X-linked juvenileretinoschisis，XLRS)致病基因的修复的研究，eaFnCpf1在人RS1编辑效率是FnCpf1的3.28到4.04倍。

4)eaFnCpf1对GFP基因序列上所有符合PAM为5’-YTV-3’的位点处的编辑效率较FnCpf1平均提高了20％。

附图说明

图1靶向突变FnCpf1示意图。

图2在人源细胞中定向筛选高活性的FnCpf1突变体模式图。

图3Library I、Library II、Library III、Library IV和Library V在site 5处的基因编辑活性数据。

图4Q125在FnCpf1结构中的位置及其被替换成不同氨基酸后FnCpf1突变体的活性。

A.Q125在FnCpf1结构中的位置；

B.Q125被替换成不同氨基酸后FnCpf1突变体的活性。

图5eaFnCpf1与FnCpf1在GFP序列PAM 5’-YTV-3’/5’-TTCV-3’位点处基因编辑活性的比较；

A.eaFnCpf1与FnCpf1在GFP序列PAM 5’-YTV-3’位点处的靶向基因编辑活性；

B.eaFnCpf1、FnCpf1、RR和eaFnCpf1-RR在GFP序列PAM/5’-TTCV-3’位点处的靶向基因编辑活性。

图6eaFnCpf1与FnCpf1对人内源性基因的编辑效率。

图7eaFnCpf1与FnCpf1应用于修复X连锁先天性视网膜劈裂症(X-linkedjuvenile retinoschisis，XLRS)致病基因的研究

A.eaFnCpf1与FnCpf1应用于修复XLRS致病基因的示意图；

B.流式细胞仪检测修复效率的数据；

C.XLRS致病基因修复后的Sanger测序结果。

表1：附加序列，突变体序列。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明做进一步描述。

参照图1-6、表1所示，本发明提供的一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具，突变体为Q125R，编码ATG的第一个氨基酸定义为1号氨基酸残基，在人源细胞中具有较FnCpf1更高的DNA切割活性和低脱靶率，被优化的底物为野生型FnCpf1，其表达载体为Addgene plasmids#69976；切割目标DNA的向导为crRNA，其表达载体为pJET-U6-crRNAs；基因突变方法为利用安捷伦诱变试剂盒靶向性突变目的片段；基因编辑用报告细胞系为293-SC1和293-RS1；mRS1基因同源重组修复模板为合成单链脱氧核糖核苷酸。

本发明提供的一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具的制备方法，包括以下步骤：

A、高活性eaFnCpf1来源于FnCpf1突变质粒库，FnCpf1突变质粒库的构建：

(1)易错PCR试剂盒靶向性诱变FnCpf1，改变WED和REC结构域；

(2)碱基突变后的FnCpf1通过无缝克隆构建表达载体，得到Library I、LibraryII和Library III三个突变库，备用于编辑细胞基因；

B、系统性筛选高活性突变体：

(1)构建靶向GFP、长21nt的crRNA的表达载体pJET-U6-crRNA-site A(后根据其靶向GFP的位置顺序更名为pJET-U6-crRNA-site 5)；

(2)293-SC1细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.9×10

(3)将野生型FnCpf1或其突变体和pJET-U6-crRNA-site 5表达载体转入上述293-SC1细胞中，在荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达情况；

(4)细胞被转染后48h，消化并收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对目标基因编辑的效率，得到430个FnCpf1突变体，其活性较野生型有所提高；

C、检测初次筛选出的430个高活性突变体的脱靶效应：

(1)分别突变上述crRNA-site 5序列上+1、+5、+10、+15和+20位核糖核苷酸，使之与与靶标DNA错配；构建相应的表达载体pJET-U6-crRNA-M5-1、pJET-U6-crRNA-M5-2、pJET-U6-crRNA-M5-3、pJET-U6-crRNA-M5-4和pJET-U6-crRNA-M5-5；

(2)293-SC1细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.9×10

(3)将pJET-U6-crRNA-M5系列表达载体依次和野生型FnCpf1转入上述293-SC1细胞中，在荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达情况；

(4)细胞被转染后48h，消化并收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1对crRNA与靶标DNA错配的容忍度；当+15位碱基错配时，WT FnCpf1的容错度最高；

(5)初次筛选出的430个高活性突变体依次与pJET-U6-crRNA-M5-4共转染293-SC1细胞，并通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对crRNA与靶标DNA错配的容忍度；初步筛选鉴定出31个可能同时兼具高活性和低脱靶率的突变体；

(6)将初步筛选鉴定出31个可能同时兼具高活性和低脱靶率的突变体依次与pJET-U6-crRNA-M5-1、pJET-U6-crRNA-M5-2、pJET-U6-crRNA-M5-3和pJET-U6-crRNA-M5-5分别共转染293-SC1细胞，并通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比进一步分析FnCpf1突变体对crRNA与靶标DNA错配的容忍度；经过综合比较，初步获得能够保持低脱靶率和在一定程度上提高了活性的6个突变体，即I-69、I-186、I-357、I-688、II-611和II-717。

为了进一步分析FnCpf1突变体对目标基因编辑的效率及其错配的容忍度即保真性，增加检测位点site B(后根据其靶向GFP的位置顺序更名为site 44)再次检测上述6个FnCpf1突变体的DAN切割活性和脱靶率，包括以下步骤：

(1)构建靶向GFP、长21nt的crRNA的表达载体pJET-U6-crRNA-site B(即pJET-U6-crRNA-site 44)，并分别突变上述crRNA-site 44序列上+1、+5、+10、+15和+20位核糖核苷酸，使之与与靶标DNA错配；构建相应的表达载体pJET-U6-crRNA-M44-1、pJET-U6-crRNA-M44-2、pJET-U6-crRNA-M44-3、pJET-U6-crRNA-M44-4和pJET-U6-crRNA-M44-5。

(2)293-SC1细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.9×10

(3)根据权利要求4所筛选得到的6个突变体分别依次与pJET-U6-crRNA-site 44、pJET-U6-crRNA-M44-1、pJET-U6-crRNA-M44-2、pJET-U6-crRNA-M44-3、pJET-U6-crRNA-M44-4和pJET-U6-crRNA-M44-5载体共转入上述293-SC1细胞中，在荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达情况；

(4)细胞被转染后48h，消化并收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对目标基因编辑的效率及其错配的容忍度即保真性。

在上述步骤C第(6)部分中，二次优化所述I-69、I-186、I-357、I-688、II-611和II-717突变体并且做筛选，包括以下步骤：

(1)等量混合I-69、I-186、I-357和I-688，使用易错PCR试剂盒靶向性诱变上述4个突变体的，改变WED和REC结构域；

(2)等量混合II-611和II-717，使用易错PCR试剂盒靶向性诱变上述2个突变体的，改变REC结构域；

(3)碱基突变后的FnCpf1通过无缝克隆构建表达载体，得到Library IV和LibraryV两个突变库，备用于编辑细胞基因；

(4)重复权利3所述的操作，系统性筛选Library IV和Library V中的突变体，得到39个具有较高活性的突变体；

(5)重复权利4所述的操作，检测二次筛选得到的39个高活性突变体的脱靶效应，去除脱靶率被提高的38个突变体，只余IV-79突变体在基因碱基效率方面得到明显提高的同时，保持了低脱靶率；

(6)重复权利5所述的操作，增加site 44位点行重复独立平行试验鉴定IV-79的切割效率提高后的稳定性、保真性和相对普遍适用性。IV-79切割活性较之野生型FnCpf1提高了40％，具有重要意义；高活性IV-79被命名为eaFnCpf1(enhanced activity FnCpf1)。

对上述获得基因编辑工具进行测序，测序获得eaFnCpf1结构的变化，包括以下步骤：

(1)通过对eaFnCpf1进行Sanger测序分析，功能域第125位氨基酸Gln(Q)被Arg(R)替代；

(2)利用PyMol结构分析软件观察eaFnCpf1晶体结构的改变，Q125位于REC1结构域域的N端，与WED-II、WED-III和PI结构域一起参与PAM的识别；Q125R的替代则规避了原Q125的δ胺与Asp129的γ-羰基之间的相互作用，使得eaFnCpf1与负电荷DNA底物之间的广泛接触；

(3)通过将Q125替换成不同性质的氨基酸得到11个相应突变体，检测其在GFP上site5、site 19和site 38处的DNA切割活性，Q125R突变体(即eaFnCpf1)获得最高的切割活性。

下面以通过补充详细数据以进一步说明实施例

参照图1-6、表1所示，本发明提供的一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具的制备方法，包括以下步骤：

A、FnCpf1突变质粒库的构建方法：

(1)易错PCR试剂盒靶向性诱变FnCpf1，胶回收PCR产物；

(2)使用HindIII和ClaI内切酶切割FnCpf1质粒，胶回收9.0kb大片段NDA作为与455bp大小的易错PCR产物无缝连接所用的骨架；使用ClaI和PshAI内切酶切割FnCpf1质粒，胶回收8.5kb大片段DNA作为骨架，与920bp大小的易错PCR产物无缝连接；使用PshAI和EcoRI内切酶切割FnCpf1质粒，胶回收6.6kb大片段DNA，与2851bp大小的易错PCR产物无缝连接。

(3)胶回收易错PCR所得片段与相符骨架行无缝克隆，转入大肠杆菌感受态细胞后涂板(氨苄抗性)；待菌落可见，在超净台里操作，挑取单克隆。

B、筛选高活性突变体：

(1)构建靶向GFP、长21nt的crRNA的表达载体pJET-U6-crRNA-site 5，其识别的靶序列附近的PAM是5’-TTTA-3’，在人细胞内该crRNA能够引导FnCpf1靶向切割GFP序列，产生DSB，造成GFP基因正常序列的突变、缺失或插入，GFP阅读框发生改变，致使GFP基因表达沉默或减弱，荧光信号消失的细胞数与编辑效率成正比；

(2)293-SC1细胞复苏：把冻存293-SC1细胞的管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。等液体都融化后(大概1～1.5min)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里；把上述细胞悬液吸到装有5ml培养基的15ml的离心管中，800rmp，离心5min；倒掉上清液，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使细胞均匀分布在培养皿中；标好细胞种类和日期、培养人姓名等，放到5％的CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。完全培养基的配制：DMEM(高糖)+10％FBS(胎牛血清)+1％Pen./Strep.(青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml)；

(3)用胰蛋白酶消化对数生长期的293-SC1细胞，细胞计数后接种于24孔板，调整细胞密度为0.9×10

(4)细胞接种24h后，将FnCpf1或其突变体和pJET-U6-crRNA-site 5通过Turbfect方法共转染293-SC1细胞；

(5)转染48h后收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对目标基因编辑的效率，在确保阴性对照组GFP沉默表达的细胞数低于5％的情况下，整理细胞流式分析数据，筛选较高活性的突变体。

C、检测高活性突变体的脱靶效应：

(1)分别突变上述crRNA-site 5序列上+1、+5、+10、+15和+20位核糖核苷酸，使之与与靶标DNA错配；构建相应的表达载体pJET-U6-crRNA-M5-1、pJET-U6-crRNA-M5-2、pJET-U6-crRNA-M5-3、pJET-U6-crRNA-M5-4和pJET-U6-crRNA-M5-5。

(2)293-SC1细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.9×105细胞/孔；

(3)将pJET-U6-crRNA-M5系列表达载体依次和野生型FnCpf1转入上述293-SC1细胞中，在荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达情况；

(4)细胞被转染后48h，消化并收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1对crRNA与靶标DNA错配的容忍度；当+15位碱基错配时，WT FnCpf1的容错度最高；

(5)将实施例2中筛选出的高活性突变体依次与pJET-U6-crRNA-M5-4共转染293-SC1细胞，并通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对crRNA与靶标DNA错配的容忍度；

(6)将实施例3(5)中筛选鉴定出的兼具高活性和低脱靶率的突变体依次与pJET-U6-crRNA-M5-1、pJET-U6-crRNA-M5-2、pJET-U6-crRNA-M5-3和pJET-U6-crRNA-M5-5分别共转染293-SC1细胞，并通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比进一步分析FnCpf1突变体对crRNA与靶标DNA错配的容错性；

(7)增加检测位点site B(后根据其靶向GFP的位置顺序更名为site 44)，用来再次检测实施例3(6)中筛选优化出的突变体：

1)构建靶向GFP、长21nt的crRNA的表达载体pJET-U6-crRNA-site B(即pJET-U6-crRNA-site 44)，并分别突变上述crRNA-site 44序列上+1、+5、+10、+15和+20位核糖核苷酸，使之与与靶标DNA错配；构建相应的表达载体pJET-U6-crRNA-M44-1、pJET-U6-crRNA-M44-2、pJET-U6-crRNA-M44-3、pJET-U6-crRNA-M44-4和pJET-U6-crRNA-M44-5。

2)293-SC1细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为0.9×105细胞/孔；

3)上述步骤C第(6)部分中，所筛选优化得到的突变体分别依次与pJET-U6-crRNA-site44、pJET-U6-crRNA-M44-1、pJET-U6-crRNA-M44-2、pJET-U6-crRNA-M44-3、pJET-U6-crRNA-M44-4和pJET-U6-crRNA-M44-5载体共转入上述293-SC1细胞中；

4)细胞被转染后48h，消化并收集细胞，通过细胞流式仪检测未表达GFP的细胞百分比分析FnCpf1突变体对目标基因编辑的效率及其错配的容忍度即保真性；综合分析选出最优突变体。

C、eaFnCpf1结构的分析：

(1)对eaFnCpf1进行Sanger测序分析，碱基突变发生在REC1结构域的N端，REC1与WED-II、WED-III和PI域一起负责PAM识别，该突变体发生了氨基酸替换Q125R；

(2)利用PyMol结构分析软件观察eaFnCpf1晶体结构的改变，Q125的α-胺直接与DNA的磷酸骨架接触，而Q125的α-羰基通过链内氢键直接与I128、D129、D130接触，似乎不会影响FnCpf1的活性。然而，突变体的晶体结构图显示Q125R阻碍了Gln125的δ胺与Asp129的γ-羰基之间的相互作用，可能增加了FnCpf1的稳定性和正电荷，使之与负电荷DNA底物之间的广泛接触，进而提高其切割活性。

(3)通过将Q125替换成不同性质的氨基酸得到11个相应突变体，系统地研究Q125的额外取代对活性的影响。当Q125变为D或E时，由于两种氨基酸的负电荷，我们观察到活性降低。Q125P导致FnCpf1的局部结构畸变，从而影响其催化活性。与FnCpf1相比，N125K和N125H在site 38处的活性也有所增加，这可能是由于两种氨基酸的负电荷。但是我们没有观察到site 5和site 19处的活性有明显的改善。

参照图7、表1所示，本发明提供的一种采用上述eaFnCpf1基因编辑器用于修复X连锁先天性视网膜劈裂症(X-linked juvenile retinoschisis，XLRS)致病基因的方法，：

(1)构建靶向mRS1序列碱基突变附近非经典PAM 5’-TTCV-3’和经典PAM 5’-YTV-3’位点处的crRNA表达载体pJET-U6-crRNA；

(2)合成单链脱氧核苷酸修复模板ssDNA，为目标DNA被切割后，细胞内的同源性修复(homology-directed repair,HDR)提供模板；

(3)293-RS1细胞复苏：把冻存293-RS1细胞的管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。等液体都融化后(大概1～1.5min)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里；把上述细胞悬液吸到装有5ml培养基的15ml的离心管中，800rmp，离心5min；倒掉上清液，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使细胞均匀分布在培养皿中；标好细胞种类和日期、培养人姓名等，放到5％的CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。完全培养基的配制：DMEM(高糖)+10％FBS(胎牛血清)+1％Pen./Strep.(青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml)；

(4)用胰蛋白酶消化对数生长期的293-RS1细胞，细胞计数后接种于24孔板，调整细胞密度为0.9×105细胞/孔；

(5)细胞接种24h后，将FnCpf1和eaFnCpf1分别依次与上述ssDNA和pJET-U6-crRNA系列载体共转染293-RS1细胞；

(6)转染5×24h后，消化并收集细胞，一部分通过流式分析仪检测GFP的表达情况比较FnCpf1和eaFnCpf1在2个位点处的编辑效率，mRS1序列碱基突变被修复后，细胞表达绿色荧光蛋白；

(7)收集的另一部分细胞，通过高通量测序检测比较FnCpf1和eaFnCpf1在mRS1上的编辑效率。

表1