羧甲基壳聚糖锌多肽复合材料的生物安全性评价

摘要

目的：
　　研究羧甲基壳聚糖锌多肽复合材料（carboxymethyl chitosanzinc and peptide，CMC-Zn+-P）的生物安全性，为材料的安全使用提供依据。
　　方法：
　　1.细胞毒性检测：在体外培养人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament cells，HPDLCs），对其形态学进行观察，并进行免疫组织化学鉴定。制取材料浸提液，以不同的浓度与细胞培养液混合，用于培养细胞，并进行分组，1～4组为实验组，材料浸提液的浓度分别为100%、75%、50%、25%，第5组为对照组，不含材料浸提液，采用CCK-8法测定不同浓度的材料浸提液对细胞增殖活性的影响，通过计算细胞的相对增殖率（RGR），对细胞毒性进行评级。
　　2.急性毒性检测：选取20只Wistar大鼠，随机分为实验组与对照组，实验组单次灌胃5 g/kg复合材料，对照组单次灌胃相同剂量的生理盐水。给药以后，大鼠正常饮食饮水，连续观察一周，记录大鼠的行为活动状态，7天后对其进行称重、取血，检测大鼠血常规及生化指标，处死后进行尸检，完整取出大鼠各脏器，计算大鼠体重相对增长率和脏器指数，并进行病理切片检查。
　　3.口腔黏膜刺激试验：选取10只Wistar大鼠，雌雄各半，麻醉后，将复合材料涂抹于大鼠的左侧口腔黏膜，将生理盐水涂抹于大鼠的右侧口腔黏膜，每侧均涂5 min，观察24 h后，将大鼠处死，并取用药部位的口腔黏膜，用10%福尔马林固定，进行HE染色，并于光学显微镜下观察。
　　4.急性皮肤刺激试验：选取10只Wistar大鼠，雌雄各半。试验前24 h剔除背部的被毛，约3 cm×5 cm大小区域，将5 g/kg体重剂量的复合材料均匀涂抹于大鼠的背部，将药物用纱布盖住，使用无刺激性的胶布将其固定。24 h后去除纱布及药物，观察试验区皮肤是否出现红斑、水肿等情况，并观察大鼠是否有中毒表现及死亡情况，连续观察一周。
　　5.长期毒性检测：选取健康的Wistar大鼠40只，将它们随机分为4组，高、中、低剂量组分别给予大鼠灌胃5 g/kg、2 g/kg、0.5 g/kg复合材料，对照组灌胃给予相同剂量的生理盐水，每天1次，连续给药3个月。3个月后，取血检测大鼠血常规及生化指标，处死后进行尸检，完整取出大鼠各脏器，计算大鼠体重相对增长率和脏器指数，并进行病理检查。
　　6.统计学处理：采用SPSS17.0软件包对数据结果进行统计学分析。
　　结果：
　　1.细胞毒性检测：体外培养的HPDLCs呈成纤维细胞的形态；免疫组化结果示细胞抗波形丝蛋白染色呈阳性，抗角蛋白染色呈阴性，培养的细胞来源于中胚层组织；不同浓度的材料浸提液对体外培养的HPDLCs均有促进增殖的作用，各组细胞的RGR均大于100%，细胞毒性分级为0级。
　　2.急性毒性检测：单次灌胃给药后，实验组与对照组的试验大鼠行为状态良好，均未出现大鼠死亡的现象，两组大鼠在体重增长、脏器指数、血常规及血液生化指标各方面的差异均无统计学意义，病理检查各组大鼠的内脏器官，未发现明显异常。
　　3.口腔黏膜刺激试验：试验用鼠未出现死亡，双侧口腔黏膜均无充血、水肿、糜烂等情况，病理切片也未见明显异常。
　　4.急性皮肤刺激试验：试验用鼠皮肤未出现红斑、充血、水肿及糜烂等异常情况,也未出现实验动物的死亡。
　　5.长期毒性检测：高、中、低剂量组与对照组相比，大鼠的体重变化、脏器指数无明显差异，各脏器无肉眼可见的病损，病理切片检查也未见明显异常，血常规结果在四组之间也无统计学差异，在血液生化指标的检测中，谷丙转氨酶（AST）、谷草转氨酶（ALT）、尿素（BUN）、葡萄糖（GLU）及肌酐（CREA）在四组中的结果差异无统计学意义，但总胆固醇（CHOL）结果出现组间差异，进一步进行两两比较发现，高剂量组与对照组之间差异显著，P＜0.001，高剂量组的CHOL含量明显高于对照组；高剂量组与中剂量、低剂量组相比，CHOL含量偏高，P=0.015，0.001；中剂量组与对照组相比，CHOL含量偏高，P=0.003；中剂量组与低剂量组以及低剂量组与对照组之间，差异无统计学意义
　　结论：
　　CMC-Zn+-P复合材料对体外培养的HPDLCs不仅无细胞毒性，而且还可促进细胞的增殖，对大鼠无急性毒性、无急性皮肤刺激毒性、无口腔黏膜刺激毒性、无长期毒性。

目录

引言

第一部分 CMC-Zn+-P复合材料的细胞毒性试验

材料与方法

1 实验试剂及材料设备

2 实验方法

3 统计学方法

结果

1 原代细胞形态鉴定

2 免疫组织化学鉴定

3 细胞生长情况

4 细胞增殖情况

讨论

第二部分 CMC-Zn+-P复合材料的动物毒性试验

材料及方法

1 研究对象及材料

2 实验方法

3 统计学方法

结果

1 急性毒性试验

2 口腔黏膜刺激试验

3 皮肤刺激试验

4 长期毒性试验

讨论

结论

参考文献

综述：壳聚糖及其衍生物在牙周病治疗方面的研究进展

攻读学位期间的研究成果

附录

致谢

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