高车前素对肾癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制研究

摘要

目的:通过体外实验探究高车前素对肾癌Caki-2和A498细胞的影响及作用机制，并在裸鼠肿瘤模型和肺转移模型中验证体外实验的结果。 方法：细胞实验：高车前素以不同浓度（5，10和20μM）和不同时间（24-72h）作用于Caki-2、A498、原代肾癌细胞和正常肾小管上皮HK-2细胞，采用CCK-8法检测各组细胞存活率的改变；采用流式细胞仪（Anexxin V/PI双染试剂盒）检测Caki-2和A498细胞凋亡比率的改变；采用Transwell和Transwell（Matrigel）检测细胞迁移和侵袭能力的改变；利用免疫印迹法检测相应指标的蛋白表达水平的变化；qRT-PCR检测细胞内SphK1mRNA表达水平变化；利用ELISA试剂盒检测Caki-2和A498细胞内Ceramide和S1P的水平改变；鞘氨醇激酶活性试剂盒检测细胞内SphK1活性的变化；SphK1siRNA、SphK1vector、SphK1抑制剂（SKI-Ⅱ）、SphK1激活剂（K6PC-5）调控细胞内SphK1的表达和活性；动物实验：构建肾癌裸鼠成瘤模型、肾癌肺转移模型评价高车前素的体内抗肿瘤活性和对肺转移的影响；免疫组化检测肿瘤组织中相关蛋白的表达；TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况；HE染色检测肺组织切片病理变化；并采用SPSS17.0软件统计分析。 结果：高车前素通过剂量和时间依赖性方式抑制Caki-2和A498细胞增殖，与正常组相比，10μM和20μM的高车前素有效的抑制Caki-2和A498细胞的增殖（p＜0.01），且20μM的抑制效果更明显。高车前素对原代肾癌细胞增殖的抑制具有剂量依赖性，而对HK-2细胞增殖没有明显影响（p＞0.05）。流式细胞仪检测结果显示10μM和20μM的高车前素作用于Caki-2和A49848h后能有效诱导肾癌细胞凋亡（p＜0.01），与正常组相比，Caki-2细胞凋亡比率由5.5%分别上升到12.2%和19.2%，A498细胞凋亡比率由4.5%分别上升到17.9%和27.2%。免疫印迹法结果也证实高车前素通过剂量依赖性方式明显增加凋亡相关分子caspase-3和PARP的活化（p＜0.01）。高车前素（10和20μM）作用细胞24h后，Transwell实验结果显示，与正常组相比，高车前素能有效的减弱Caki-2和A498细胞的迁移和转移能力，药物处理之后穿透到Transwell下室细胞数量明显减少（p＜0.01），且抑制作用具有剂量依赖性。10μM和20μM的高车前素还能有效增加细胞内E-cadherin的表达（p＜0.01），降低N-cadherin的表达（p＜0.01）。10μM和20μM高车前素作用细胞48h后，细胞内Ceramide水平明显升高（p＜0.01），S1P水平明显降低（p＜0.01），且SphK1活性显著降低（p＜0.01）。免疫印迹法和qRT-PCR结果表明，与正常组相比，10μM和20μM高车前素对SphK1的蛋白水平和mRNA水平没有影响，差异无显著性意义（p＞0.05），但能有效的降低SphK1的磷酸化水平（p＜0.01），且减少细胞膜上SphK1的表达（p＜0.01），增加细胞质中SphK1的表达（p＜0.01）。与20μM高车前素组相比，20μM高车前素+SKI-Ⅱ组和20μM高车前素+SphK1siRNA有效的增强20μM高车前素对Caki-2和A498细胞增殖、凋亡、侵袭、转移以及相关蛋白表达的影响（p＜0.01）。与20μM高车前素组相比，20μM高车前素+SphK1vector和20μM高车前素+K6PC-5组均能有效的逆转高车前素对Caki-2和A498细胞增殖、凋亡、侵袭、转移以及相关蛋白表达的影响（p＜0.01）。体外实验：与对照组相比，20和40mg/kg/day的高车前素能有效的抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、增加肿瘤组织中TUNEL阳性细胞数，上调Ceramide和cleaved caspase-3表达，降低p-SphK-1和Ki-67表达（p＜0.01）。与对照组相比，40mg/kg/day的高车前素能有效的减少肾癌的肺转移结节数，减少肺组织病理变化（p＜0.01）。 结论：高车前素通过抑制SphK1的活性，调节细胞内Cer和S1P之间的平衡来影响肾癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭，且高车前素对SphK1活性的调节与抑制其磷酸化，由胞质向胞膜转移相关。因此，高车前素可作为SphK1的潜在抑制剂。

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