大肠杆菌耐热性肠毒素STI突变体构建及毒性的研究

摘要

ETEC是一类导致人和幼畜腹泻(初生仔猪、犊牛、羔羊和断奶仔猪)的病原性大肠杆菌，主要有两类致病因子：一类为肠毒素，另一类为黏附素(或称定居因子)。菌体产生的多种外毒素在大肠杆菌致病性中扮演了重要角色，其中耐热性肠毒素即为其产生的主要外毒素。
　　 本研究首先利用PCR技术，从产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922中克隆出STI基因，进一步通过PCR和寡核苷酸定点突变技术，将耐热性肠毒素STI毒素中心的3个Cys分别突变成Ser和Gly，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得了该突变基因的重组菌株。在此基础上，对重组菌株的诱导表达产物进行了Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析；并对蛋白的毒性进行了研究。从而为进一步研制预防产肠毒素性大肠杆菌引起的犊牛、羔羊坏死性肠炎等疾病提供理想的基因工程候选菌株。研究结果如下：
　　 1.利用PCR技术，从产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922中克隆出STI毒素基因，并进行了核苷酸序列测定。结果表明，核苷酸序列与国外报道的序列一致。
　　 2.通过PCR和寡核苷酸定点突变技术，将耐热性肠毒素STI毒素中心的3个Cys分别突变成Ser和Gly，并且成功获得了大肠杆菌耐热性肠毒素STI的6种突变体(Cys→Gly)：STIC10/G、STIC14/G、STIC17/G，突变体(Cys→Ser)：STIC10/S、STIC14/S、STIC17/S。在此基础上，进一步成功构建了含有6种STI突变体的分泌型表达载体pESG10、pESG14、pESG17、pESS10、pESS14、pESS17及相应的重组菌株。
　　 3.对重组菌株经IPTG诱导后，将表达产物进行Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析，结果表明，该重组菌株可以表达耐热性肠毒素STI突变体蛋白，蛋白含量占菌体总蛋白最高比例可达30％。并且表达的突变体蛋白能够被抗血清特异性识别。
　　 4.对重组菌株进行了毒性研究，动物实验表明重组菌株毒性明显减弱。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文缩略词表

声明

第一章引言

1.1研究目的和意义

2.1课题相关研究进展

第二章大肠杆菌耐热性肠毒素STI基因的克隆及定点突变

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5小结

第三章大肠杆菌耐热性肠毒素STI突变体构建及表达

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5小结

第四章 大肠杆菌耐热性肠毒素STI突变体的毒性研究

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4讨论

4.5小结

第五章 结论

参考文献

致谢

附录

作者简历