酿酒酵母发酵法制备还原型谷胱甘肽的初步研究

摘要

还原型谷胱甘肽(简称GSH)是一种天然活性肽，具有清除自由基、解毒等多种生理功能。本文利用酿酒酵母发酵法生产GSH，对发酵工艺进行了优化，对菌体作为原料提取GSH和阳离子交换树脂纯化GSH等进行了研究。 研究建立了高效液相法测定谷胱甘肽含量的检测条件，在本文的检测条件下，在0.02～0.4mg/mL的浓度范围内谷胱甘肽浓度与峰面积成很好的线性关系(R2=0.9999)，精密度良好(RSD=0.28％)，加标回收率为99.99％。研究了ALLOXAN法对谷胱甘肽含量检测的情况，结果表明谷胱甘肽的浓度和吸光度值成很好的线性关系(R2=0.9991)，因此本章建立的两种方法都能够准确和快速的检测谷胱甘肽的含量。 考察了培养基组成和发酵条件对酿酒酵母发酵合成谷胱甘肽的影响，确定了培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO410g/L，MgSO4·7H2O3g/L，KH2PO45g/L，FeSO410-5mol/L，ZnSO410-5mol/L。在此培养基组成的基础上，对发酵条件进行优化，优化后的发酵条件为：种龄24h，接种量15％，发酵培养基的装液量为30ml/250ml三角瓶，培养温度28℃，摇床转速220r/min，发酵时间72h。酿酒酵母在优化后的发酵工艺条件下进行发酵，谷胱甘肽的合成量由优化前的43.5mg/L发酵液提高至235.8mg/L发酵液。 对从酿酒酵母细胞中提取谷胱甘肽进行了研究，首先考察了不同pH值和不同温度下，溶液中谷胱甘肽的稳定性情况。接着采用热水提取和乙醇溶液提取两种方法提取酿酒酵母中的谷胱甘肽，对提取条件进行了优化，比较了两种方法提取所得的谷胱甘肽产量。两种方法所得的谷胱甘肽产量很接近，综合考虑两种方法的优缺点，本实验选择采用40％乙醇溶液提取法对酿酒酵母中的谷胱甘肽进行提取。 最后采用001×7(732)型阳离子交换树脂对提取液中谷胱甘肽进行了初步的分离纯化，确定了优化的纯化条件。阳离子交换树脂对谷胱甘肽纯化后的回收率为76.3％，蒸干得到谷胱甘肽粗品，用高效液相法测定其谷胱甘肽含量为21.8％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1引言

1.2谷胱甘肽的结构和理化性质

1.3谷胱甘肽的代谢

1.4谷胱甘肽的生理功能与应用

1.4.1谷胱甘肽在医药领域的应用

1.4.2谷胱甘肽在食品工业上的应用

1.5谷胱甘肽的制备

1.5.1溶剂提取法

1.5.2化学合成法

1.5.3酶合成法

1.5.4发酵法

1.6谷胱甘肽的检测

1.6.1荧光法

1.6.2碘量法

1.6.3紫外分光光度法

1.6.4毛细管电泳法

1.6.5高效液相色谱法(HPLC)

1.7立题背景和研究意义

第二章还原型谷胱甘肽分析方法的建立

2.1实验材料

2.1.1主要药品与试剂

2.1.2仪器和设备

2.2 HPLC法

2.2.1色谱条件

2.2.2标准品储备液的配制

2.2.3液相检测谱图

2.2.3线性考察

2.2.4精密度实验

2.2.5加标回收率实验

2.3 ALLOXAN法

2.3.1 ALLOXAN法测定谷胱甘肽的原理

2.3.2试剂配制

2.3.3标准曲线的制作

2.3.4样品中谷胱甘肽浓度的测定

2.4小结

第三章 发酵工艺对酿酒酵母生物合成谷胱甘肽的影响

3.1实验材料

3.1.1菌种

3.1.2培养基

3.1.3主要药品与试剂

3.1.4仪器和设备

3.2实验方法

3.2.1菌体培养方法

3.2.2 谷胱甘肽含量分析方法

3.2.3培养基组成的优化

3.2.4发酵条件的优化

3.3结果与讨论

3.3.1基础发酵培养基发酵所得谷胱甘肽产量

3.3.2培养基组成优化实验结果

3.3.3发酵条件优化实验结果

3.4小结

第四章谷胱甘肽的提取分离

4.1实验材料

4.1.1主要药品与试剂

4.1.2仪器和设备

4.2实验方法

4.2.1谷胱甘肽稳定性研究

4.2.2热水提取谷胱甘肽的研究

4.2.3乙醇溶液提取谷胱甘肽的研究

4.2.4两种提取方法的比较

4.3结果与讨论

4.3.1温度对谷胱甘肽稳定性的影响

4.3.2 pH值对谷胱甘肽稳定性的影响

4.3.3热水提取谷胱甘肽的研究

4.3.4乙醇溶液提取谷胱甘肽的研究

4.3.5两种提取方法的比较

4.4小结

第五章 阳离子交换树脂对谷胱甘肽提取液的分离纯化

5.1实验材料

5.1.1主要药品与试剂

5.1.2仪器和设备

5.2实验方法

5.2.1谷胱甘肽提取液的制备

5.2.2树脂的预处理方法

5.2.3树脂的再生方法

5.2.4静态吸附实验

5.2.5树脂的填装和上样

5.2.6水洗除杂质

5.2.7洗脱

5.2.8洗脱剂的选择

5.2.9洗脱剂浓度的选择

5.2.10洗脱流速的选择

5.2.11纯化结果的分析测定

5.3结果与讨论

5.3.1上样pH值的影响

5.3.2上样浓度的影响

5.3.3洗脱剂的选择

5.3.4洗脱剂浓度的选择

5.3.5洗脱流速的选择

5.3.6分离纯化结果

5.4小结

结论

参考文献

发表文章

致谢