益生菌Lactobacillus casei Zhang免疫调节和抗肿瘤作用及机理研究

摘要

本课题以内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室从传统发酵酸马奶中分离鉴定的240株乳杆菌中，经前期大量实验确立的一株具有明显益生特性的乳杆菌Lactobacillus．caseiZhang(Lb．caseiZhang)为研究对象，观察了其对实验小鼠的的免疫调节及抗肿瘤作用，并探讨了其可能的作用机理。 前期的大量研究表明：益生菌Lb．caseiZhang具有优良的益生特性和降胆固醇、抗氧化和免疫调节等对机体有益的功能特性。本课题探讨了益生菌Lb．caseiZhang免疫调节及抗肿瘤方面的功能特性，为其进一步开发应用提供了实验依据。实验分四部分： 第一部分：采用动物活体试验方法，Lb．caseiZhang制备成热致死菌体和活菌制剂各分成高、中、低三个剂量组灌服小鼠15天，测定胸腺指数、脾脏指数；观察ConA促进脾淋巴细胞增殖作用、脾脏巨噬细胞吞噬中性红的能力。采用ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-12、IL-1α、TNF-α的含量。 第二部分：Lb．caseiZhang活菌制剂分高、中、低三个剂量组灌服小鼠。分别于第3、7、11、15天，摘取脾脏，计算脾指数：RT-PCR法测定脾脏中IL-2和IL-2RαmRNA的转录水平，并从小鼠局部肠粘膜免疫组织及免疫细胞着手，对服用Lb.caseiZhang后小鼠肠道局部免疫组织-Peyer's结的数量计分进行了研究。采用免疫组化法检测小肠粘膜CD3+、IgA+细胞数量并通过图象分析软件分析其阳性信号平均光密度值了解其表达情况。 第三部分：以荷H22肝癌小鼠为模型，用Lb.caseiZhang活菌制剂分高、中、低三个剂量灌服小鼠12天后，滴片法测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数；计算脾指数，计算肿瘤生长抑制率，ELISA法测定血清中肿瘤坏死因子-β(TNF-β)的含量；免疫组化法检测小鼠肿瘤细胞中癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax蛋白的表达程度，从分子水平探讨其抗肿瘤的可能机制。 第四部分：以荷H22肝癌化疗小鼠为模型，观察Lb．caseiZhang对化疗药物的减毒增效作用。以腹腔注射环磷酰胺(CTX)联甩Lb．caseiZhang活菌制剂高、中、低三个剂量灌服小鼠12天后，计算脾指数、肿瘤生长抑制率，并对小鼠肠道局部免疫组织-Peyer's结进行计数计分；采用原位杂交法检测肿瘤细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，采用碘化丙啶(PI)染色利用流式细胞仪检测肿瘤细胞细胞周期及凋亡率。 实验结论是：具有明显益生特性的乳杆菌Lb．caseiZhang对实验小鼠的细胞免疫、体液免疫、肠道粘膜免疫可产生多方面的、有利于机体免疫功能状态的调节作用；对体外移植性小鼠肝癌H22肿瘤具有明显的抑制生长作用，对化疗药环磷酰胺(CTX)具有明显的减毒增效作用，其抗肿瘤的机制可能是通过增强荷瘤小鼠的免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略词表

声明

1引言

1.1益生菌概念的由来

1.2益生菌的来源和主要菌种

1.3益生菌的特点

1.4益生菌的生理功能

1.5益生菌作用机理

1.6乳酸菌免疫调节作用及机理的研究进展

1.6.1乳酸菌对非特异性免疫功能的影响

1.6.2乳酸菌对特异性免疫功能的影响

1.6.3乳酸细菌与其免疫活性的关系

1.7乳酸菌抗肿瘤作用及机理的研究进展

1.7.1抗肿瘤作用

1.7.2抗肿瘤机制

1.8关于Lb.casei Zhang

1.8.1 Lb.casei Zhang来源及特性

1.8.2 Lb.casei Zhang研究基础

1.9本论文研究的目标及意义

2实验一 益生菌 Lb.casei Zhang活菌及灭活菌制剂对正常小鼠免疫活性的影响

2.1材料

2.1.1实验菌种

2.1.2实验动物

2.1.3实验器具

2.1.4试剂

2.1.5仪器

2.2方法

2.2.1 Lb.casei Zhang的来源及制剂制备

2.2.2实验动物分组及饲喂方式

2.2.3小鼠体重及免疫脏器指数(Immune organ index，IOI)的测定

2.2.4 Lb.casei Zhang对小鼠脾淋巴细胞转化代谢水平的影响(MTT法)

2.2.5非特异性免疫功能的评价(巨噬细胞吞噬试验-Lb.casei Zhang对小鼠脾脏巨噬细胞吞噬功能的影响)

2.2.6小鼠血清中细胞因子含量的测定

2.2.7统计学分析

2.3结果

2.3.1小鼠一般状况、体重变化及胸腺、脾指数测定结果

2.3.2 ConA促进脾淋巴细胞增殖转化实验

2.3.3小鼠脾脏巨噬细胞吞噬中性红能力

2.3.4细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-1α、TNF-α的测定

2.4讨论

3实验二益生菌 Lb.casei Zhang不同作用时间对小鼠细胞免疫及肠道免疫功能的影响

3.1材料

3.1.1实验菌种

3.1.2实验动物

3.1.3实验器具

3.1.4试剂

3.1.5仪器

3.2方法

3.2.1 Lb.casei Zhang的培养

3.2.2试验动物及饲喂方式

3.2.3小鼠脾指数的测定

3.2.4小鼠脾脏中IL-2和IL-2R α mRNA转录水平的测定:

3.2.5小鼠肠道Peyer's结(Peyer's patches，PP)观察

3.2.6小肠的取材、切片的制备及免疫组化

3.2.7数据的统计与分析

3.3结果

3.3.1小鼠脾指数的测定:

3.3.2脾脏中IL-2和IL-2R mRNA转录水平的测定:

3.3.3小肠Peyer's结的计数、计分、结构观察

3.3.4光镜观察小肠各段组织结构

3.3.5小肠粘膜CD3+、IgA+细胞数及表达强度

3.4讨论

3.5小结

4实验三益生菌 Lb.casei Zhang对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及机制研究

4.1材料

4.1.1实验菌种

4.1.2实验动物

4.1.3瘤株

4.1.4鸡红细胞(chicken red blood cell，CRBC)

4.1.5实验器具

4.1.6试剂

4.1.7仪器

4.2方法

4.2.1 Lb.casei Zhang的培养

4.2.2小鼠肝癌模型的建立

4.2.3分组及处理

4.2.4腹腔巨噬细胞吞噬CRBC功能的测定

4.2.5小鼠脾指数的测定

4.2.6对移植性肿瘤抑制作用的研究

4.2.7血清TNF-β含量测定

4.2.8 H22肿瘤细胞Bcl-2和Bax蛋白免疫组化检测

4.2.9数据的统计与分析

4.3结果

4.3.1荷瘤小鼠一般状况

4.3.2 Lb.casei Zhang对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

4.3.3小鼠脾指数的测定:

4.3.4 Lb.casei Zhang对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

4.3.5 Lb.casei Zhang对H22荷瘤小鼠血清TN-β含量的影响

4.3.6 Lb.casei Zhang对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞Bcl-2和Bax表达的影响

4.4讨论

5实验四 益生菌 Lb.casei Zhang对化疗荷H22肿瘤小鼠的减毒增效作用的研究

5.1材料

5.1.1实验菌种

5.1.2实验动物

5.1.3瘤株

5.1.4实验器具

5.1.5试剂

5.1.6仪器

5.2方法

5.2.1 Lb.casei Zhang的培养

5.2.2小鼠肝癌模型的建立

5.2.3分组及处理

5.2.4小鼠脾指数的测定

5.2.5对荷瘤小鼠肿瘤抑制作用的研究

5.2.6小鼠肠道Peyer's结计数、计分观察

5.2.7原位杂交检测肿瘤细胞PCNAmRNA表达

5.2.8流式细胞仪PI染色法检测肿瘤细胞细胞周期及凋亡率

5.2.9数据的统计与分析

5.3结果

5.3.1荷瘤化疗小鼠一般状况

5.3.2荷瘤化疗小鼠脾指数测定

5.3.3荷瘤化疗小鼠肿瘤生长抑制率测定

5.3.4荷瘤化疗小鼠小肠Peyer's结的计数、计分

5.3.5原位杂交检测肿瘤细胞PCNA阳性表达率

5.3.6流式细胞仪分析肿瘤细胞周期分布及凋亡率

5.4讨论

5.5小结

6结论

致谢

参考文献

附录

作者简介