牛乳产蛋白酶菌分离鉴定及产酶条件的研究

摘要

试验从呼市地区鲜牛乳中分离得到65株蛋白酶生产菌，从中筛选出产蛋白酶较高的3株菌进行生理生化鉴定，同时对其产酶条件及发酵工艺进行优化。最终选出高产蛋白酶且具稳定性的菌株进行分子鉴定、酶学性质研究及通过诱变处理进一步提高产蛋白酶能力。 产蛋白酶较高较稳定的三株菌Bs4、Bs15、Bs2917通过生理生化试验鉴定为枯草芽孢杆菌。对产蛋白酶最高且稳定的Bs4菌株进行形态特征观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析结果表明为枯草芽孢杆菌。其中Bs4菌株的最佳培养条件：温度为37℃、pH6.5、培养时间为36h、接种量为3％，酶活力可达到1888.73L/mL： Bs15菌株的最佳培养条件：温度为32℃、pH7.5、培养时间为36h、接种量为3％，酶活力可达到712.18L/mL； Bs2917菌株的最佳培养条件：温度为32℃、pH7.O、培养时间为48h、接种量为3％，酶活力可达到367.57U/mL。 通过单因素试验和正交试验可知Bs4菌株最优培养基配方为：玉米粉33.4g/L，麸皮33.4g/L，豆饼粉30.8g/L，（NH4）2HPO4/KH2PO412.09g/L，经37℃，36h培养测得酶活力为2129.31L/mL； Bs15菌株最优培养基配方为：玉米粉29.95g/L，麸皮29.95g/L，豆饼粉31.8g/L，（NH4）2HPO4/NaH2PO45.9g/L，经32℃，36h培养后实际测得菌株酶活力为1390.79U/mL。 对菌株Bs4进行酶学性质研究发现酶最适作用温度为57℃，最适pH为7.0.该酶具有一定的热稳定性，40℃保温30min，活力几乎没有损失，50℃保温60min仍保留40％的酶活力，超过50℃稳定性下降，70℃，20min酶活力全部丧失：Mg2+、ca2+、K+对酶有一定的激活作用和稳定作用，Zn2、Fe3+对酶有一定的抑制作用。 对菌株Bs4进行了紫外、微波、亚硝酸盐等单因子诱变处理，得到突变菌株UB-12产酶活力为3014 U/mL，其出发菌产酶活力提高了40％左右。该菌株经遗传稳定性试验可知产酶水平稳定，为工业化生产酶制剂提供了优良菌株。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1引言

1.1 芽孢杆菌

1.2蛋白酶

1.3微生物蛋白酶

1.4芽孢杆菌蛋白酶

1.5微生物诱变育种

1.5.1物理诱变

1.5.2化学诱变

1.6研究目的和意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1标准菌株

2.1.2样品来源

2.1.3化学试剂

2.1.4主要培养基

2.1.5主要仪器设备

2.2试验方法

2.2.1 高产蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选

2.2.2菌株鉴定

2.2.3培养条件对产酶的影响

2.2.4液体发酵条件的优化

2.2.5酶学性质的初步研究

2.2.6诱变选育高产蛋白酶菌株

3结果与分析

3.1 高产蛋白酶菌株的筛选

3.1.1 酪氨酸标准曲线图

3.1.2菌株的分离

3.1.3菌种初筛结果

3.1.4菌种复筛结果

3.1.5菌种鉴定

3.2培养条件对产酶的影响

3.2.1 温度对产酶的影响

3.2.2初始pH对产酶的影响

3.2.3菌株的最佳产酶时间

3.2.4接种量对产酶的影响

3.3液体发酵条件的优化

3.3.1 不同碳源对产酶的影响

3.3.2氮源对菌株产酶的影响

3.3.3最佳缓冲盐的确定

3.3.4培养基配方的优化

3.4酶学性质的初步研究

3.4.1酶最适作用温度

3.4.2酶最适pH值

3.4.3酶热稳定性分析

3.4.4金属离子对酶稳定性的影响

3.5诱变选育高产蛋白酶菌株

3.5.1 菌株生长曲线的测定

3.5.2诱变条件的选择

3.5.3产蛋白酶突变菌株的筛选

4讨论

5结论

致 谢

参考文献

附 图

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