益生菌Lactobacillus casei Zhang长期连续传代过程中遗传稳定性研究

摘要

本研究以从我国少数民族地区自然发酵酸马奶中分离、筛选得到的一株益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang为研究对象，以普通MRS培养基和碳源限制性MRS培养基作为连续培养的基质，以1％接种量每24h传代一次，每个传代周期菌株生长log2100≈6.64代，分析其在长期连续传代过程中的表型特征、益生特性及基因组水平的变化，对该菌的稳定性做出系统评价。
　　研究结果显示，在连续培养2000代期间，L. casei Zhang的细胞和菌落形态没有变化，且连续培养并不会改变培养周期内总生物量和周期末活菌数；对各种碳水化合物的代谢能力也没有改变，且菌种活力保持良好。益生菌 L. casei Zhang在两种培养基中连续培养2000代期间生长情况持续较好，具有非常稳定的表型特征，没有发现衰退现象。对益生菌L. casei Zhang的基本益生特征的跟踪分析表明，L. casei Zhang对pH2.5的人工胃液以及pH8.0的人工肠液耐受能力、胆盐的耐受能力无变化，反应益生菌粘附性的自凝集率也没有受连续培养代数及 MRS培养基种类的影响而发生变化，益生菌L. casei Zhang的这些益生特性在连续培养2000代期间均较稳定。利用Miseq高通量测序平台，在对L. casei Zhang在两种培养基中连续培养至1000代和2000代的基因组重测序分析，共发现44处SNP突变位点和23个InDel突变位点。碳源限制性MRS培养基中1000代中发现SNP突变位点平均数量少，多数为高频突变，一旦建立，将稳定遗传，显示经历了选择压力；在2000代菌株中高频率SNP突变位点增加2个，表明此时选择压力已经下降，出现种群分化现象。同时，在两种培养基中L. casei Zhang传代菌株中均发现在基因rpoC中出现了高频率突变，据此推测L. casei Zhang在不同培养条件下发生着一种趋同进化，高速生长的细菌占有竞争优势。
　　总体而言，益生菌L. casei Zhang的基因组在两种培养基中连续传代培养2000代过程中高频突变较少，并且1000代低频突变在2000代有消失的迹象，可能菌株已适应在这一类似的环境，并在这一环境中可长期生存。从基因组水平编码基因的突变水平证实了L. casei Zhang在长期传代培养过程中具有稳定表型特征及益生特性。综合以上研究揭示益生菌L. casei Zhang在连续培养时具有良好的遗传稳定性，是一株不可多得的可安全使用的益生菌菌种。

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缩 略 语 表

1 引言

1.1 益生乳酸菌

1.2 益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang的研究背景

1.3 基因组重测序技术

1.4 遗传稳定性的研究

1.5 立题意义与研究内容

2 材料与方法

2.1 菌株来源

2.2 主要试剂

2.3 主要设备

2.4 实验方法

3 结果与讨论

3.1 益生菌Lactobacillus casei Zhang连续培养情况

3.2 益生菌Lactobacillus casei Zhang在传代期间的表型特征稳定性

3.3 传代期间益生特性稳定性

3.4 传代期间基因组稳定性

4 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介