乳杆菌属基因组多态性及德氏乳杆菌保加利亚亚种微进化研究

摘要

Lactobacillus是乳酸菌最大的一个属，在人和动物胃肠道微生态平衡有着重要的作用，也是乳制品发酵剂以及益生菌产品的主要菌株，保加利亚乳杆菌更是乳制品发酵剂必不可少的菌种之一。系统解析乳杆菌属以及保加利亚乳杆菌的遗传背景和进化历程对开发利用乳杆菌有着极其重要的意义。本研究采用基因组重测序技术完成了146株Lactobacillus模式菌株基因组的测定，结合公共数据库中已完成的3株Lactobacillus模式菌株的全基因组序列，深入解析了149株Lactobacillus模式菌株的种系发育情况和物种分化历程，同时以305株L.delbrueckii subsp.bulgaricus分离株为研究对象，采用多位点序列分型技术对其进行微进化分析，得出如下结论:
　　(1)完成了146株Lactobacillus模式菌株全基因组精细图的绘制，建立了含有72个基因的Lactobacillus核心基因集，大于70000个基因的泛基因集，结合基因组大小、GC含量、编码蛋白数量以及ANI和TNI值，显示出Lactobacillus基因组遗传多样性极其丰富，高于传统细菌分类学定义中的“科”。
　　(2)基于基因组序列重构代表26个门、421个属的系统发育树，指出Oenococcus、Pediococcus、 Weissella、Leuconostoc帮Lactobacillus属于一个进化分支Lactobacilluscomplex，而Lactococcus、Streptococcus和Enterococcus处于Lactobacillus complex分化前的另一个分支。
　　(3)以72个核心基因为依据从基因组水平重构乳杆菌不同种的系统发育关系，所有乳杆菌模式菌株分为2个大的进化分支。进一步分析揭示了属于兼性异型发酵的乳杆菌模式菌株占据这一属的古老分支，即祖先位置，属于严格同型发酵、严格异型发酵的乳杆菌模式菌株则占据年轻分支，为后代菌株。同时发现处于第1进化分枝的动物源乳杆菌伴有生态位移动现象，第2进化分枝的动物源乳杆菌在动物生境和其他生境中呈现平行进化现象。
　　(4)采用8个管家基因的多位点序列分型技术305株L.delbrueckii subsp.bulgaricus区分为121个ST型，组成14个同源复合体。通过STRUCTURE种群分析预测了可能存在5个主要的祖先群体，并推断蒙古国地区L.delbrueckii subsp.bulgaricus分离株更接近最早的祖先群体。
　　(5)进一步分析表明L.delbrueckii subsp.bulgaricus祖先株与蒙古国地区分离株最接近，呈现从蒙古国地区向俄罗斯布里亚特、图瓦、卡尔梅克和中国新疆、青海、西藏等地区传播的趋势。并指出L.delbrueckii subsp.bulgaricus不同序列型与其分离源、分离地有着直接的关系。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 乳杆菌属

1．1．1 乳杆菌属的分类学地位

1．1．2 乳杆菌属内的归类

1．1．3 保加利亚乳杆菌

1．2 微进化及研究方法

1．2．1 微进化理论

1．2．2 微进化的机制

1．2．3 乳酸菌微进化的机制

1．2．4 乳酸菌微进化的研究方法

1．3 MLST技术及其在乳酸菌微进化的应用

1．3．1 MLST技术

1．3．2 MLST技术在乳酸菌微进化研究中的应用

1．4 全基因组在乳酸菌微进化的应用

1．5 立题意义与研究内容

1．5．1 立题意义

1．5．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 菌株来源

2．1．1 Lactobacillus模式菌株来源

2．1．2 L．delbrueckii subsp．bulgaricus分离株来源

2．2 主要试剂

2．3 主要设备

2．4 生物信息学分析软件

2．5 实验方法

2．5．1 Lactobacillus模式菌株活化及基因组DNA的提取

2．5．2 Lactobacillus模式菌株全基因组测序、组装和预测

2．5．3 Lactobacillus模式菌株进化分析

2．5．4 L．delbrueckii subsp．bulgaricus分离株MLST基因选取和引物设计

2．5．5 L．bulgaricus分离株活化、DNA提取以及PCR扩增、测序

2．5．6 L．bulgaricus分离株MLST数据分析

3 结果分析及讨论

3．1 Lactobacillus模式菌株基因组特征

3．1．1 Lactobacillus模式菌株核心基因和泛基因集

3．1．2 Lactobacillus基因组ANI和TNI分析

3．2 基于全基因组构建Lactobacillus系统发育分析

3．2．1 Lactobacillus complex的系统发育分析

3．2．2 Lactobacillus遗传谱系与发酵类型的关系

3．2．3 Lactobacillus遗传谱系与不同生境的关系

3．2．4 动物来源Lactobacillus进化特征

3．3 基于全基因组序列种水平的分类

3．4 L．delbrueckii subsp．bulgaricus微进化分析

3．4．1 L．delbrueckii subsp．bulgaricus等位基因ST识别

3．4．2 L．delbrueckii subsp．bulgaricus种群结构分析

3．4．3 L．delbrueckii subsp．bulgaricus系统发育网络分析

3．4．4 L．delbrueckii subsp．bulgaricus重组事件分析

3．4．5 不同序列型eBURST分析

3．4．6 不同序列型与分离源关联分析

3．4．7 不同序列型合并基因系统发育分析

4 结论

5 本论文的主要创新点

致谢

参考文献

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