蒙古冰草干旱胁迫下内参基因的筛选及P5CS基因定量表达分析

摘要

蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）属于禾本科植物，具有很高的饲用价值和生态价值。主要分布于内蒙古、山西西北部、陕西北部、甘肃、宁夏、新疆等地区，以及中亚、蒙古等国家。在年降水量200～300mm地区能够生长，是干旱草原和荒漠草原重要的牧草。本研究以蒙古冰草为研究对象，应用实时荧光定量PCR技米，检测了actin2、l8S rRNA，、APRT、EF-1α、RNApollⅡ、TUBα、TUBβ、GAPDH、TLF9个常见内参基因在于旱胁迫中的表达稳定性，筛选适宜蒙古冰草研究的内参基因，并利用筛选到的内参基因分析了蒙古冰草P5CS基因在干旱胁迫及复水后的表达情况。
　　本研究主要内容包括：⑴在干旱胁迫下，蒙古冰草表达最稳定的内参基因是18S rRNA基因，其次是EF-1α、TLF，表达最不稳定的是actin2。⑵在干旱胁迫下，18S rRNA和TLF是最稳定内参基因组合，可以用于以后蒙古冰草在干旱胁迫下基因定量表达时的首选内参基因组合。⑶在干旱胁迫第3d脯氨酸含量显著上升，随着干旱胁迫处理的延续，到第15d达到最大值。复水之后出现明显的降低，到复水处理第6d基本上恢复到正常水平。⑷P5CS基因的表达量明显受到干旱胁迫的诱导。在干旱处理的第3d，蒙古冰草P5CS的表达量上升，随着干旱胁迫的加剧，第12d达到了最大值，然后表达量开始下降，但是仍然比对照组高。复水之后第3d，P5CS的表达量开始下降，到复水处理后的第6d，P5CS的表达量基本上恢复到正常水平。⑸蒙古冰草干旱胁迫及复水处理中，叶片游离脯氨酸含量与P5CS基因的表达量成正相关关系(R2=0.7703，P＜0.05)。本研究确立了蒙古冰草在干旱胁迫下荧光定量PCR的内参基因，为蒙古冰草在干旱胁迫下基因的定量表达检测奠定了基础;定量分析了P5CS的表达及与脯氨酸含量的变化的关系，为揭示蒙古冰草抗旱的分子机理研究奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 蒙古冰草及研究现状

1．2 P5CS研究进展

1．3 荧光定量PCR及内参基因

1．3．1 荧光定量PCR

1．3．2 内参基因

1．4 本研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料的培养与处理

2．2 实验仪器和试剂

2．2．1 主要的实验仪器

2．2．2 主要实验试剂

2．3 实验方法

2．3．1 蒙古冰草叶片中脯氨酸含量的测定

2．3．2 蒙古冰草叶片总RNA的提取和检测

2．3．3 cDNA的合成

2．3．4 引物设计

2．3．5 候选内参基因的普通PCR

2．3．6 候选内参基因的荧光定量PCR

2．3．7 蒙古冰草P5CS基因荧光定量PCR反应

2．4 数据分析

2．4．1 候选内参基因熔解曲线、扩增曲线和扩增效率分析

2．4．2 geNorm分析

2．4．3 NormFinder分析

2．4．4 叶片中游离脯氨酸含量结果分析

2．4．5 P5CS的表达量及其与脯氨酸含量的相关性分析

3 结果与分析

3．1 蒙古冰草叶片中脯氨酸的含量

3．2 蒙古冰草叶片总RNA提取

3．3 候选内参基因的普通PCR电泳检测

3．4 候选内参基因荧光定量PCR数据分析结果

3．4．1 内参基因的特异性表达

3．4．2 geNorm分析

3．4．3 NormFinder分析

3．4．4 蒙古冰草内参基因综合分析结果

3．5 P5CS基因表达分析

3．5．1 P5CS基因表达分析

3．5．2 P5CS基因的表达与脯氨酸含量的相关性

4 讨论

4．1 内参基因的筛选

4．2 干旱胁迫下蒙古冰草叶片中脯氨酸含量变化分析

4．3 蒙古冰草干旱胁迫下P5CS基因的定量表达与叶片中脯氨酸含量的关系

5 结论

致谢

参考文献

附录

作者简介