大针茅干旱胁迫下qRT-PCR内参基因的筛选及PIP2s基因的表达分析

摘要

大针茅（Stipa grandis P.Smirn）是亚洲中部特有的典型草原种，对大针茅的实生苗经干旱胁迫处理后，进行了如下研究:
　　根据已公布的内参基因序列设计引物，利用qRT-PCR方法，从肌动蛋白基因（Act2）、微管蛋白a基因(TUB-a)、微管蛋白b基因（TUB-b）、18S核糖体RNA基因(18SrRNA)、甘油醛-3磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、真核延伸因子基因（EF-1a）、RNA聚合酶Ⅱ基因(RNA POLⅡ)、腺嘌呤磷酸核糖转化酶基因(APRT)、翻译因子基因(TLF)9个候选基因中，利用△Ct值分析法及geNorm、NormFinder软件分析法综合比较各个候选基因的稳定值，筛选出在干旱胁迫下大针茅根部表达最稳定的内参基因是18S rRNA，其次是EF-1a和TLF,最不稳定的内参基因为RNA POLⅡ;其中最稳定的内参基因组合为18S rRNA和EF-1a。在叶片中表达稳定的内参基因顺序依次为18S rRNA、TLF和EF-1a，最不稳定的内参基因是TNB-b;其中最稳定的内参基因组合为18S rRNA和TLF。
　　根据已经克隆的大针茅PIP2;1和PIP2;2基因保守区序列设计简并引物，利用qRT-PCR方法对大针茅水孔蛋白基因PIP2;1和PIP2;2的表达进行研究，结果表明:在干旱胁迫下大针茅的PIP2;1和PIP2;2基因在根部的表达量均远远高于叶片的表达量，并且随着干旱胁迫强度的增加这两个基因的表达量都不同程度的上调，其中PIP2;1基因在干旱胁迫20d时表达量达到最高，约为对照的2.2倍，之后又有所下降;而PIP2;2在干旱胁迫15d时就已经达到了最大表达量，约为对照的2.5倍，之后表达量开始下降。说明PIP2;1和PIP2;2基因参与了大针茅的水分运输生理过程。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 针茅属植物的简介

1．2 水孔蛋白基因的功能简介及研究进展

1．3 实时荧光定量PCR技术

1．3．1 技术原理

1．3．2 优越性及应用

1．4 实时荧光定量POR的内参基因

1．4．1 理想内参基因的要求

1．4．2 传统内参基因的缺陷

1．5 候选内参基因稳定性的分析方法

1．5．1 geNorm程序

1．5．2 NormFinder程序

1．6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 大针茅种子采集及幼苗处理

2．1．2 主要仪器设备及试剂

2．2 实验方法

2．2．1 大针茅总RNA提取和检测

2．2．2 大针茅cDNA的合成

2．2．3 候选内参基因的引物设计

2．2．4 候选内参基因目的片段的合成

2．2．5 候选内参基因的荧光定量PCR反应体系及程序

2．3 不同条件下PIP2亚家族基因的表达分析

2．4 荧光定量PCR数据分析

3 结果与分析

3．1 大针茅RNA的电泳检测

3．2 候选内参基因目的片段的克隆

3．3 候选内参基因引物特异性及qRT-PCR扩增效率

3．3．1 引物特异性

3．3．2 候选内参基因引物qRT-PCR扩增效率

3．4 内参基因qRT-PCR数据分析

3．4．1 △Ct值分析法

3．4．2 geNorm软件分析法

3．4．3 NormFinder软件分析法

3．4．4 干旱胁迫下最佳内参基因的获得

3．5 干旱胁迫下PIP2；1和PIP2；2亚家族基因的表达差异

3．5．1 PIP2；1和PIP2；2基因qRT-PCR引物特异性

3．5．2 PIP2；1和PIP2；2基因标准曲线的制备

3．5．3 PIP2；1和PIP2；2基因的表达分析

4 讨论

4．1 内参基因的选择及稳定性

4．2 干旱胁迫下PIP2；1和PIP2；2基因与大针茅的水分利用

5 结论

致谢

参考文献

附录

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