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奶牛乳房炎性S.aureus生物膜鉴定与免疫原性的研究

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摘要

缩略语表

1 引言

1.1 奶牛乳房炎概述及其类型

1.1.1 奶牛乳房炎的概述

1.1.2 奶牛乳房炎的分类

1.1.3 奶牛乳房炎的检测方法

1.1.4 奶牛乳房炎的综合防治

1.2 S.aureus的研究

1.2.1 S.aureus的生物学特征

1.2.2 S.aureus的毒力因子

1.3 生物膜的论述

1.3.1 细菌生物膜的耐药机制

1.4 S.aureus生物膜多糖的研究进展

1.5 S.aureus的纤连素结合蛋白

1.6 S.aureus生物膜多糖的提取及纯化

1.6.1 S.aureus的生物膜多糖的提取

1.6.2 S.aureus生物膜多糖的纯化

1.7 S.aureus BP偶联物的制备

1.7.1 S.aureus BP的免疫原性

1.7.2 偶联制剂的研究

1.7.3 ELISA检测血清抗体效价

1.8 本论文的设计思路

1.8.1 研究目的和意义

1.8.2 技术路线

2 S.aureus的分离鉴定及药敏实验

2.1 实验材料

2.1.1 样品来源

2.1.2 培养基及化学试剂

2.1.3 实验仪器和耗材

2.2 实验方法

2.2.1 乳样的采集

2.2.2 细菌的分离鉴定

2.2.3 细菌的药敏实验

2.3 结果

2.3.1 细菌分离鉴定结果

2.3.2 细菌生化鉴定结果

2.3.3 葡萄球菌API Staph鉴定结果

2.3.4 细菌药敏实验结果

2.4 讨论

2.4.1 内蒙古呼市奶牛乳房炎的病原菌分离

2.4.2 细菌常用药物的选择

3 葡萄球菌生物膜形成能力的鉴定及多糖的提取纯化

3.1 实验材料

3.1.1 培养基和试剂

3.1.2 实验仪器和耗材

3.2 实验方法

3.2.1 生物膜的定性检测

3.2.2 生物膜的定量实验

3.2.3 扫描电镜鉴定生物膜

3.2.4 S.aureus生物膜的提取及纯化

3.2.5 生物膜粗提物含糖量的测定

3.2.6 S.aureus生物膜多糖的纯化

3.3 结果

3.3.1 生物膜定性结果

3.3.2 生物膜定量结果

3.3.3 扫描电镜鉴定生物膜的结果

3.3.4 生物膜多糖的提取结果

3.3.5 生物膜多糖含量的计算

3.3.6 生物膜多糖纯化后的浓度

3.3.7 生物膜多糖中核酸的含量

3.3.8 蛋白质含量的计算

3.4 讨论

3.4.1 生物膜的定性定量结果分析

3.4.2 扫描电镜法观察S.aureus生物膜

3.4.3 生物膜多糖的粗提方法

3.4.4 生物膜多糖含量的测定

3.4.5 生物膜多糖纯化分析

4 生物膜多糖偶联物的制备及免疫原性的检测

4.1 实验材料

4.1.1 实验试剂

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验动物

4.2 实验方法

4.2.1 实验试剂的配制

4.2.2 活化衍生S.aureus生物膜多糖

4.2.3 制备生物膜多糖偶联物

4.2.4 生物膜多糖—偶联物免疫原性的研究

4.3 结果

4.4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

作者简介

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摘要

奶牛养殖业中由S.aureus引起的奶牛乳房炎是造成极大经济损失的常见多发病之一。生物膜的形成是造成S.aureus感染的重要因素。由于细菌生物膜的形成使其具备了更强的耐药性,在食品、医疗等领域危害严重,从而影响人类社会。本实验对内蒙古某牧场的79份奶样进行了细菌的分离鉴定和药敏实验,在此基础上筛选出防治奶牛乳房炎的最佳药物。将生化鉴定为葡萄球菌的菌株做了生物膜的定性、定量及扫描电镜的观察和API-Staph鉴定。将产生生物膜能力最强的S.aureus在含1%葡萄糖的TSB中培养5天后,采用加酶法、过葡聚糖层析柱法对提取的生物膜多糖进行纯化,多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法。最后将纯化的生物膜多糖和FnBPA-D区蛋白进行偶联制备偶联物。把偶联物免疫BalB/C小白鼠,并用间接ELISA检测血清抗体效价。
  实验结果表明:79份奶样中共检出48株细菌,大肠杆菌22株,检出率45.8%;葡萄球菌17株,检出率35.4%;链球菌7株,检出率为14.6%;枯草杆菌2株,检出率为4.17%。通过细菌的药敏实验结果显示3种主要病原菌均对环丙沙星、左氟沙星和头孢噻肟敏感。API-Staph鉴定有6株为S.aureus。挑选生物膜产生能力强的S.aureus在1%葡萄糖的TSB液体培养基中培养,提取及纯化多糖的纯度为9.42%,精制多糖的纯度为64.68%。核酸和蛋白质的含量分别是0.0286mg/mL、0.009mg/mL。将制备的偶联物免疫小白鼠后用间接ELISA法检测血清抗体效价,单独的生物膜多糖组和阴性对照组没有产生抗体,偶联物组产生了抗体且最高效价是1∶12800,证明了偶联物可以刺激小白鼠产生免疫应答,具有良好的免疫原性。

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