防控奶牛乳房炎的S.aureus噬菌体JS25规模化制备工艺及其应用安全性评价

摘要

金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种可引起多种局部或全身严重感染性疾病的病原菌，亦是奶牛乳房炎的重要病原菌之一。抗生素的长期大量使用导致金黄色葡萄球菌出现多重耐药，给该菌引起的各种疾病的治疗带来极大困难。因此，寻找安全有效的方法治疗多耐药金黄色葡萄球菌引起的各类感染迫在眉睫，噬菌体研究的兴起为多重耐药菌治疗提供了可能。本实验室分离获得了金黄色葡萄球菌噬菌体JS25，宿主谱广，能有效杀灭引起奶牛乳房炎的分离病原株。在前期工作基础上，为实现噬菌体的产业化生产应用，本论文开展了噬菌体JS25的规模化制备工艺及其应用安全性评价。
　　实验一:研究了金黄色葡萄球菌噬菌体JS25的规模制备工艺。选用20 mL液体增值体系筛选研究噬菌体JS2520 L发酵体系的最佳培养基、培养时间、感染复数、增殖温度和转速，最后确定了最适培养基0.5×TSB-YE、最适培养时间8h-10h、最佳感染复数MOI=1×10-4、最适温度37℃和最佳转速180rpm，以相同的条件用于发酵罐培养可以将实验室原有扩增噬菌体的效率提升30倍。研究发现发酵后噬菌体及实验室扩增所得噬菌体的电镜图及生物学特性无显著差异，这为噬菌体的大量生产及应用提供了理论依据。
　　实验二:研究了规模制备的噬菌体的贮藏条件和应用效果。最终确定最适保存温度为4℃，规模化制备的环境消毒剂对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌及大肠杆菌的灭菌率均达到90％以上。
　　实验三:以小鼠为模型评价了规模化制备噬菌体JS25的应用安全性。实验通过短期或长期以噬菌体JS25免疫小鼠，分别测定噬菌体对小鼠的急性毒性、特异性免疫毒性及非特异性免疫毒性指标。实验选用ICR小鼠为模型，分别研究了粗纯和精纯噬菌体对小鼠中性粒细胞百分数、淋巴细胞百分数和细胞因子的影响。特异性免疫组每隔14d免疫一次1010 pfu/mL金黄色葡萄球菌噬菌体JS25(200μL)，精纯对照组注射等量PBS，每隔7d测定一次小鼠体内IgM和IgG的变化情况。结果表明:金黄色葡萄球菌噬菌体JS25无急性毒性;在注射粗纯和精纯噬菌体4h后，粗纯组和精纯组较对照组淋巴细胞百分数均出现了显著下降(P＜0.05)，中性粒细胞百分数显著升高(P＜0.05)，24小时后精纯组淋巴细胞百分数和中性粒细胞百分数均回到与对照组相同的水平，但粗纯组一直保持显著差异(P＜0.05)。特异性免疫组结果表明:噬菌体在注射后短时间内IgM和IgG迅速升高，但IgM在7d后出现下降并保持在较低水平，而IgG则随着免疫次数的增加持续升高。噬菌体不会对小鼠免疫系统造成影响，但持续使用噬菌体会造成IgG的持续升高使得噬菌体在小鼠体内的消除速度加快。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 奶牛乳房炎

1．1 奶牛乳房炎概述

1．2 奶牛乳房炎的病因

1．3 奶牛乳房炎的治疗措施

2 金黄色葡萄球菌

2．1 金黄色葡萄球菌的概述

2．2 金黄色葡萄球菌的毒力因子与致病机理

3 噬菌体及其应用

3．1 噬菌体的概论

3．2 噬菌体的分类

3．3 噬菌体治疗的优势

3．4 噬菌体治疗的劣势

3．5 噬菌体的应用

4 研究的目的及意义

第二章 奶牛场奶牛乳房炎的调研报告

1 调研目的

2 调研内容及调研方式

2．1 奶牛场基本情况

2．2 奶牛乳房炎的治疗措施及用药情况

3 关于乳房炎发病原因分析

4 对乳房炎发病防治的建议

4．1 管理方面

4．2 治疗方法

4．3 预防方面

第三章 噬菌体JS25的规模化发酵制备工艺研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25的20L发酵罐制备条件优化

1．4 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25增殖最适培养基的选择

2．2 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25最适培养时间

2．3 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25增殖最佳感染复数

2．4 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25增殖最适温度

2．5 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25最适培养转速

2．6 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25的发酵罐培养

2．7 规模化制备噬菌体与实验室制备噬菌体

3 讨论

4 小结

第四章 生物消毒剂的制备及效果研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 规模制备的金黄色葡萄球菌噬菌体JS25纯化

2．2 粗纯的金黄色葡萄球菌噬菌体JS25的保存条件研究

2．3 环境生物消毒剂的制备及效果研究结果

3 讨论

4 小结

第五章 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25的应用安全性评价

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 数据统计与分析

2 结果与分析

2．2 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25对小鼠非特异性免疫毒性的影响

2．3 金黄色葡萄球菌噬菌体JS25对小鼠特异性免疫毒性的影响

3 讨论

4 小结

全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文和申请发明专利

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