内蒙传统发酵奶油制品中CLA产生菌的筛选及发酵条件优化

摘要

本论文从传统发酵奶油制品中分离筛选出生产共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid；CLA）产量较高的菌株，利用气相色谱法（Gas Chromatography；GC）分析发酵液中CLA异构体的组成情况，并对筛选所得菌株的培养基和发酵条件进行优化以提高其产量，实验结果如下：
　　1．从传统发酵奶油制品中分离筛选产CLA水平高的乳酸菌。利用溴甲酚紫平板对产CLA的乳酸菌进行初筛，再利用紫外分光光度法检测发酵液中CLA含量进行复筛以筛选出高产菌株，分析其菌落特征、细胞形态及生理生化特性，并结合16S rDNA序列分析以及系统发育树，鉴定其种属。从样品中共筛出30株产CLA菌株，当LA按发酵培养基的0.06％（v/v），接种量为2%（v/v）时，分离自镶黄旗酸油的11株产CLA菌株中，HS4产量最高，为23.59±0.99μg/mL，经鉴定其为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）；分离自正蓝旗稀奶油的9株产CLA菌株中，LX5产量最高，为20.51±0.55μg/mL，经鉴定其为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）；分离自阿巴嘎旗酸油的10株产CLA菌株中，AS8产量最高，为13.22±0.52μg/mL，经鉴定其为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。
　　2．气相色谱法（GC）分析发酵液中CLA的异构体组成情况。菌株HS4所产产物中c9，t11-CLA和t10，c12-CLA在发酵液脂肪酸中的峰面积分别为0.75%和0.71%，相对含量分别为37.94%和35.76%；菌株LX5所产产物中c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的峰面积分别为0.75%和0.72%，相对含量分别为35.09%和33.40%；菌株AS8所产产物中c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的峰面积分别为0.78%和0.70%，相对含量分别为31.67%和28.75%。
　　3．利用LB培养基、MRS培养基、脱脂乳培养基对培养基的种类进行初步优化，确定了菌株HS4、LX5、AS8的最适发酵培养基均为MRS培养基。通过单因素试验和正交试验优化3株菌的培养基成分，得到HS4、AS8最优培养基成分为：蛋白胨(10g/L)、牛肉膏(10g/L)、酵母浸膏(7g/L)、葡萄糖(2.5%)、乙酸钠(7g/L)、柠檬酸氢二铵(2g/L)、磷酸氢二钾(3g/L)、硫酸锰(2g/L)、硫酸镁(10g/L)，Tween-80(0.10%)；LX5最优培养基成分为：蛋白胨(10g/L)、牛肉膏(15g/L)、酵母浸膏(7g/L)、葡萄糖(2.5%)、乙酸钠(7g/L)、柠檬酸氢二铵(2g/L)、磷酸氢二钾(3g/L)、硫酸锰(2g/L)、硫酸镁(10g/L)，Tween-80(0.10%)。
　　4．通过单因素试验和响应面方法（RSM）优化菌株HS4、LX5、AS8的发酵条件。得到菌株HS4的最佳发酵条件为：培养温度33℃，培养时间37h，LA添加量0.08%(v/v)，接种量2.72%(v/v)；菌株LX5的最佳发酵条件为：培养温度33℃，培养时间36h，LA添加量0.07%(v/v)，接种量2.70%(v/v)；菌株AS8的最佳发酵条件为：培养温度33℃，培养时间36h，LA添加量0.09%(v/v)，接种量2.74%(v/v)。3株菌在优化后的条件下，其 CLA产量分别提高到43.88±0.75μg/mL、39.91±0.38μg/mL、28.67±0.99μg/mL，分别是未优化前的1.86倍、1.94倍、2.17倍。

目录

1 引言

1.1 共轭亚油酸的结构与特点

1.2 共轭亚油酸的生理学功能

1.3.1 天然来源

1.3.2 化学合成

1.3.3 微生物合成

1.4 共轭亚油酸的检测方法

1.5 本课题的研究目的与意义

1.6 本课题的研究内容与创新点

2 材料与方法

2.1 试验材料与仪器

2.1.1 样品来源

2.1.2 药品与试剂

2.1.3 仪器与设备

2.2.1 产CLA乳酸菌的分离与筛选

2.2.2 CLA高产菌株的种属鉴定

2.2.3 气相色谱法(GC)分析CLA异构体组成

2.2.4 产CLA发酵培养基的优化

2.2.5 发酵条件的响应面法（RSM）优化

3 结果与分析

3.1 产CLA乳酸菌的分离与筛选

3.1.1 CLA紫外吸收标准曲线

3.1.2 产CLA菌株筛选与水平检测

3.2 CLA高产菌株的种属鉴定

3.2.1 菌落与细胞形态特征

3.2.2 菌株生化特性

3.2.3 菌株生理特性

3.2.4 菌株16S rDNA基因序列分析与系统发育树的构建

3.3 气相色谱法(GC)分析CLA异构体组成情况

3.4 菌株发酵培养基的优化

3.4.1 不同培养基对CLA产量的影响

3.4.2 碳源的优化与添加量的确定

3.4.3 氮源的优化与氮源比例的确定

3.4.4 无机盐的优化与无机盐比例的确定

3.4.5 吐温-80添加量的确定

3.5 菌株发酵条件的优化

3.5.1 培养温度的影响

3.5.2 初始pH值的影响

3.5.3 培养时间的影响

3.5.4 LA添加量的影响

3.5.5 接种量的影响

3.5.6 响应面法（RSM）优化发酵条件

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介