沙冬青原生质体分离与蛋白质亚细胞定位分析技术的建立

摘要

植物原生质体是进行蛋白质亚细胞定位等瞬时表达实验的主要受体之一，建立其分离与纯化技术是开展相关研究的重要前体条件。蒙古沙冬青是典型的强抗逆植物，本文建立其原生质体分离与瞬时表达转化技术体系，同时以模式植物拟南芥的原生质体瞬时表达体系做参照，利用该体系对蒙古沙冬青的两个抗逆相关基因AmDREB1F和AmDREB2进行了蛋白亚细胞定位分析。
　　本研究主要内容包括：⑴以蒙古沙冬青无菌苗幼叶为材料，采用一步酶解法，初步建立其原生质体分离与纯化技术：酶解液组成为3％纤维素酶+0.5%离析酶+0.3%半纤维素酶+9%甘露醇+0.15%CaCl2，pH5.8；酶解方法为25℃、避光、40 rpm震荡反应14 h；原生质体纯化用W5溶液作为洗液，在700rpm离心5min。⑵成功将AmDREB1F、AmDREB2和AmCAT基因的编码区cDNA构建到植物瞬时表达载体 pBI-GFP上，获得 pBI-AmDREB1F-GFP、pBI-AmDREB2-GFP和pBI-AmCAT-GFP三个融合蛋白表达载体。⑶利用PEG介导法将构建的表达载体转化拟南芥原生质体和本论文分离的蒙古沙冬青原生质体，进行蛋白质亚细胞定位分析，结果将 AmDREB1F和AmDREB2初步定位在细胞核中，而AmCAT可能定位于过氧化物酶体。

目录

声明

1 引言

1.1 植物原生质体分离研究概况

1.1.1 原生质体的特点和应用

1.1.2 原生质体的分离与纯化及其影响因素

1.1.3 原生质体产量与活力的测定

1.2 植物蛋白质亚细胞定位分析方法

1.2.1 报告基因

1.2.2 转化受体材料

1.2.3 转化方法

1.3 本研究的目的和意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.2 所用引物

2.3.1 缓冲液及主要试剂的配制

2.3.2 沙冬青原生质体分离与纯化

2.3.3 沙冬青原生质体产量与活力检测

2.3.4 蛋白亚细胞定位预测

2.3.5 植物瞬时表达载体的构建

2.3.6 重组表达载体质粒DNA的提取

2.3.7 质粒DNA导入拟南芥原生质体与荧光显微观察

2.3.8 质粒DNA导入沙冬青原生质体与荧光显微观察

3 结果与分析

3.1 蒙古沙冬青原生质体分离与纯化技术的建立

3.1.1 酶解液中不同酶类浓度的确定

3.1.2 酶解液中渗透压稳定剂浓度的确定

3.1.3 酶解时间的确定

3.1.4 离心速度的选择

3.1.5 原生质体活力的检测

3.2 蒙古沙冬青抗逆相关基因植物瞬时表达载体的构建

3.2.1 目的基因片段的PCR扩增与测序验证

3.2.2 目的基因片段与瞬时表达载体的连接与鉴定

3.3 AmDREB1F、AmDREB2和AmCAT蛋白的亚细胞定位分析

3.3.1 三种蛋白亚细胞定位的生物信息学预测

3.3.2 利用拟南芥原生质体进行蛋白亚细胞定位分析

3.3.3 利用蒙古沙冬青原生质体进行蛋白亚细胞定位分析

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介